应用寡核苷酸芯片检测非小细胞肺癌遗传易感相关的代谢酶基因多态性

摘要

背景： 肺癌是严重危害人类健康的恶性肿瘤之一，其发病率与死亡率均位于各种恶性肿瘤之首，且仍有不断增长的趋势。非小细胞肺癌(non-smallcelllungcancer，NSCLC)占肺癌发病总数的80％，大部分NSCLC患者就诊时已处于晚期，2/3的病人确诊时已失去手术机会，中位生存期仅8～10月，5年生存率低于15％。过去30年，尽管治疗肿瘤的技术和方法有了很大的改进和发展，但肺癌的死亡率并没有下降，因此早期诊断和有效预防是目前降低肺癌发病率和死亡率最具潜力的方法之一。 恶性肿瘤是基因-环境相互作用引起的。机体癌变过程中，不同个体对各种致癌因素的抗争能力存在差异，造成差异的遗传物质基础之一就是广泛存在于基因中的单核苷酸多态性(Singlenucleotidepolymorphisms，SNPs)，这可能赋予了个体对某种环境因素易感。国内外大量研究证实多种代谢酶基因都存在SNPs，它们与NSCLC遗传易感性可能存在密切关系。因此进行多基因SNP的监测，筛选出与NSCLC相关的易感基因，有助于鉴别易感人群，指导NSCLC的早期诊断和有效防治。 目的： 代谢酶细胞色素氧化酶(CYP)和谷胱甘肽转硫酶(GST)在外源性致癌物的代谢活化、DNA损伤与修复过程中起重要作用。这些代谢酶基因的多态性引起其编码代谢酶功能的异常，可能赋予了个体患癌易感性的差异。 国内外大量研究运用DNA测序法、聚合酶链-限制性长度多态性(PCR-RFLP)等方法检测这些代谢酶基因的SNP，进而分析它们与NSCLC易感性的关系。近年来芯片技术以其快速、高效、并行、高通量等优点逐渐应用于多基因多位点SNP的检测。本研究采用寡核苷酸芯片技术检测NSCLC患者代谢酶基因CYP1A1ml、m2位点和GSTM1的基因多态性，通过DNA测序验证该技术用于检测SNP的可行性；并分析这三种SNP与NSCLC易感性的关系及它们与环境因素之间、多SNP之间的相互联系。 方法： 2006年1月至2007年5月，病例组为山东省肿瘤医院就诊的NSCLC患者110例，均经细胞学或组织病理学确诊且未经放射、化学治疗，其中鳞癌68例(61.8％)，腺癌31例(28.2％)，其他类型11例(10％)，中位年龄58.1岁。对照组为医院健康体检者125例，中位年龄59.2岁。两组均为山东汉族人，性别、年龄采用频数配对，并以问卷形式收集研究对象的人口学资料、吸烟史、职业史等。采集2组外周血标本2ml，应用Fastagen公司血标本DNA提取试剂盒按照操作步骤提取外周血DNA。根据Genebank数据库的序列资源设计寡核苷酸探针，制备芯片，将提取的DNA通过PCR扩增出靶序列与芯片杂交，通过Scanarray4000扫描并读取杂交结果。利用DNA测序法鉴定芯片的检测结果。应用SPSS13.0软件进行数据统计分析，以x2检验对不同基因型之间的差异进行分析，用非条件Logistic回归模型计算比值比(oddsratios，OR)及其95％可信区间(confidenceintervals，CI)，全部检验均为双侧检验，P＜0.05为差异有统计学意义。 结果： 1.应用测序法对部分扩增基因片段进行测定，与寡核苷酸芯片检测结果完全吻合。 2.110例NSCLC中，CYP1A1基因m1位点A、B和C基因型的分布频率分别为35.45％、24.55％和40.00％；对照组125例健康体检者的分布频率为38.40％、32.80％和28.80％。3种基因型分布在两组间的差异无显著性(P＞0.05)。 3.110例NSCLC中，CYP1A1基因m2位点Ⅱe/Ⅱe、Ⅱe/Val和Val/Val基因型分布频率为16.36％、72.73％和10.91％；125例健康体检者的分布频率为28.00％、66.40％和5.60％。Val/Val基因型在两组分布差异有统计学意义(P=0.03)；携带此基因型的个体发生NSCLC的风险为Ⅱe/Ⅱe基因型的3.33倍(95％CI1.12～9.93)。 4.110例NSCLC中，GSTM1wt和nu11基因型的分布频率分别为40.00％和60.00％；对照组125例健康体检者的分布频率为54.40％和45.60％。GSTM1基因型分布在两组间亦有明显差异(P=0.03)；携带GSTM1nu11型的个体患肺癌的风险是wt型的1.79倍(95％CI1.07～3.01)。 5.按照吸烟分层分析结果显示：CYP1A1m2位点Val/Val基因型的吸烟个体患肺癌的风险增加7.15倍(95％CI2.96～17.24，P=0.00)，GSTM1nu11基因型的吸烟个体患肺癌的风险增加4.55倍(95％CI1.96～10.59，P=0.00)。 6.多基因联合作用分析显示：携带CYP1A1A/GSTM1nu11基因型、CYP1A1(B+C)/GSTM1nu11基因型发生NSCLC的风险分别为1.75、1.86(P＞0.05)。CYP1A1(Ⅱe/Val+Val/Val)/GSTM1nu11基因型发生NSCLC的风险为2.18(P＞0.05)。无论CYP1A1ml位点基因型如何，至少携带一个CYP1A1m2Val突变基因且GSTM1缺失的个体发生NSCLC的风险分别为2.40、2.28(P＞0.05)。 结论： 1.寡核苷酸芯片是一种检测基因多态性的快速、准确、高效、高通量的方法，可以完成对多基因多个位点多态性的并行检测。 2.CYP1A1m2位点Val/Val基因型和GSTM1nu11基因型是山东汉族人群发生NSCLC的易感基因型，可以作为分子标志用于NSCLC高危人群或易感个体的筛选及早期诊断。CYP1A1ml位点基因多态性与NSCLC易感性无显著相关。 3.在NSCLC的发病过程中，CYP1A1m2位点Val/Val基因型、GSTM1nu11基因型与吸烟存在协同作用。 4.多基因多态性联合作用分析显示，在NSCLC的发病过程中CYP1A1ml、m2位点和GSTM1三种基因多态性之间不存在协同作用。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：主要符号表

声明

研究生导师和课题指导小组介绍

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

附录

综述 SNP与肺癌遗传易感性研究进展

攻读学位期间发表的学术论文

致谢