自身免疫性疾病抗体检测芯片诊断产品开发研究

摘要

自身免疫性疾病(Autoimmunedisease，AID)是指机体免疫系统对自身抗原发生免疫应答，产生自身抗体及(或)自身致敏淋巴细胞，攻击自身靶抗原和组织，使其产生病理改变和功能障碍而导致的疾病。近年来，AID的发病率呈明显上升，约占世界总人口的3～5％，我国患者超过1200万。自身抗体是AID最重要的特征，对AID的诊断和鉴别诊断、病情评估、病程转归与预后判断等都具有重要的临床应用价值。 目前临床上开展的自身抗体检测方法主要有间接免疫荧光法、酶联免疫吸附法、免疫印迹法、免疫斑点法等，其中多数检测方法仍以手工操作为主，检测程序较复杂，不能同时检测多种自身抗体，给临床检测带来较多的麻烦，同时检测成本也高。蛋白芯片具有的高通量、平行检测、自动化等优点，为简便、快速、同时检测多种自身抗体的解决带来了希望。目前已报道的蛋白芯片的检测方法大部分是采用荧光检测。该方法虽然灵敏度较好，但需要专用的扫描仪，使应用受到了限制。 NBT/BCIP显色方法是一种常用的、稳定的检测系统，在实验室和临床上应用广泛。而该显色方法在蛋白芯片中的应用至今还没有相关的报道，因此，有必要将这种常用的检测方法和新的蛋白芯片技术体系结合，开发适用于不同级别临床需要的简便、快速、可同时检测多种自身抗体的蛋白芯片技术体系。 目的： 选择临床上常用的用于自身免疫性疾病抗体检测所对应的12种抗原，运用NBT/BCIP显色反应策略，对芯片的制备条件进行优化，研制一种可同时检测12种自身抗体的蛋白芯片技术体系。 方法： 1.抗原的选择、制备 选择临床上常用的用于自身免疫性疾病抗体检测所对应的12种抗原，自行制备核抗原和双链DNA(dsDNA)，CCP采用商业合成，其余抗原从公司购买。 2.玻片的选择和制备 采用我们实验室已经建立的并得到专利授权的APES修饰的玻片作为点样的基片并制备。 3.抗原点样液、点样浓度、血清稀释度的优化及蛋白芯片cutoff值的确定 运用NBT/BCIP显色反应策略，对每一种抗原的点样液、点样浓度、血清稀释度进行优化，确定所制备蛋白芯片的阳性Cu。toff值和阴性Cu‘toff值。 4.蛋白芯片敏感度和特异度的评价： 用我们研制的显色反应蛋白芯片对临床血清标本进行检测，评估蛋白芯片对每种自身抗体检测的敏感度和特异度，并进行统计和分析。 结果： 1.抗原的选择、制备 我们针对临床常见的AID的检测需要，和目前可以获得的抗原，确定的12种抗原分别是ANA，Ro-60/SSa，La/SSb，Jo-1，Scl-70，Sm，Ro-52/SSa，RF，CCP，ulRNP，CENP-B和dsDNA。以自行提取的Hep-2细胞核蛋白作为检测ANA的核抗原，提取人基因组dsDNA作为检测抗dsDNA抗体的抗原，CCP采用商业合成，其余抗原从公司购买。 2.玻片的选择和制备 按照我们的专利技术，制备APES修饰玻片作为点样的基片。 3.抗原点样液、点样浓度、血清稀释度的优化及蛋白芯片cutoff值的确定 优化出的点样液为0.1％TBST:12种抗原的点样浓度分别为：ANA520μg/ml，Ro-60/SSa465μg/ml，La/SSb530μg/ml，Jo-1530μg/ml，Scl-70525μg/ml，Sm520μg/ml，Ro-52/SSa615μg/ml，RF340μg/ml，CCP-465μg/ml，ulRNP410μg/ml，CENP-B490μg/ml，dsDNA580μg/ml；血清稀释度为1:4；阳性对照Ⅱ为250μg/mlHumanIgG，也即芯片的阳性cutoff值；阴性对照为5μg/mlHumanIgG，也即芯片的阴性cutoff值；阳性对照I为500μg/mlHumanIgG，作为强阳性的判定标准和芯片的质控区。 4.蛋白芯片敏感度和特异度的评价： 应用我们的显色反应蛋白芯片技术体系和方法，对12种自身抗体的检测敏感度分别为：ANA93.1％，抗Ro-60/SSa抗体81.4％，抗La/SSb抗体91.1％，抗Jo-1抗体81.0％，抗Scl-70抗体84.5％，抗Sm抗体93.5％，抗Ro-52/SSa抗体90.8％，RF90.1％，抗CCP抗体91.2％，抗ulRNP抗体96.3％，抗CENP-B抗体80.9％，抗dsDNA抗体80％；特异度分别为：ANA93.3％，抗Ro-60/SSa抗体98.3％，抗La/SSb抗体100％，抗Jo-1抗体95.8％，抗Scl-70抗体97.5％，抗Sm抗体89.2％，抗Ro-52/SSa抗体95.0％，RF86.7％，抗CCP抗体90.8％，抗ulRNP抗体96.7％，抗CENP-B抗体95.0％，抗dsDNA抗体98.3％。蛋白芯片检测结果与目前采用的单个抗体检测方法的检测结果无显著性差异，两者的符合率分别为ANA93.2％，抗Ro-60/SSa抗体93.9％，抗La/SSb抗体97.1％，抗Jo-1抗体92.0％，抗Scl-70抗体93.2％，抗Sm抗体90.7％，抗Ro-52/SSa抗体93.5％，RF88.1％，抗CCP抗体91.0％，抗ulRNP抗体96.6％，抗CENP-B抗体91.0％，抗dsDNA抗体94.7％；总体符合率为92.8％。 结论： 运用NBT/BCIP显色反应策略，研制了一种可同时检测12种常用自身抗体的蛋白芯片技术体系；该技术与传统的检测技术有的符合率为；但是该技术体系具有快速、方便、高通量、廉价等优势，易于商业化，适合不同条件的临床需要。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:主要符号表

声明

研究生导师简介

第一部分前言

1蛋白质芯片

1.1技术背景

1.2工作原理和分类

1.3制备及分析过程

1.4应用

1.5优点、存在的问题和展望

2自身免疫性疾病及自身抗体的检测现状

2.1AID的定义、分类和发病机理

2.2自身抗体的检测技术现状

2.3蛋白芯片在自身抗体检测中的应用

3.本研究的目的及意义

第二部分蛋白芯片制备条件的优化及在自身抗体检测中的应用

1材料和方法

1.1抗原的选择和制备

1.2培养Hep-2细胞并提取其核蛋白作为核抗原

1.3从全血中提取人基因组dsDNA

1.4固相基片的选择与制备

1.5抗原点样液、点样浓度、血清稀释度的优化及芯片cutoff值的确定

1.6蛋白芯片敏感度和特异度的评价及应用

1.7重复性检测

1.8稳定性检测

2实验结果

2.1核蛋白的提取及蛋白定量

2.2 dsDNA的提取

2.3抗原点样液、点样浓度、血清稀释度和芯片cutoff值的优化结果

2.4蛋白芯片敏感度和特异度的评价结果

2.5重复性检测

2.6稳定性检测

3.讨论

3.1抗原选择及各种自身抗体对自身免疫性疾病的诊断价值

3.2蛋白芯片制备条件的优化

3.3蛋白芯片的初步应用评价

3.4蛋白芯片在临床推广应用中面临的问题

4 结论

4.1抗原的选择和制备结果表明:

4.2抗原点样液、血清稀释度的优化结果

4.3抗原点样浓度、芯片cutoff值的优化结果结果表明:

4.4蛋白芯片检测自身抗体的敏感度和特异度的评价结果表明

4.5蛋白芯片的重复性表明:

4.6蛋白芯片的稳定性表明:

全文小结

参考文献

综述 蛋白芯片在自身免疫性疾病中的应用

攻读硕士学位期间的研究成果

致谢