宫颈鳞癌组织中P73α，ATM表达水平与放射敏感性及预后相关性研究

摘要

背景: 宫颈鳞癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一，尤其是近年来出现全球发病年轻化趋势，严重威胁着广大妇女的健康。放疗是中、晚期宫颈癌的主要治疗方式之一，但晚期患者单一放疗后5年生存率仅有33％～45％。因此，宫颈癌细胞对放疗的敏感性是放射治疗中必须考虑的问题。 放射敏感性的四个主要因素是：是否乏氧细胞、乏氧克隆细胞所占的比例、肿瘤放射损伤的修复、肿瘤细胞的固有敏感性。目前采用的宫颈癌常规放疗，大多是不同个体使用相似的放疗方案。但是不同个体放射敏感性有明显差异，如何针对不同个体采用更具合理的放疗方案显得极为重要。随着人类基因组计划的完成及分子生物学技术的发展，在分子水平预测诊断疾病以做到个体化治疗是将来医学发展的必然趋势。2002年，欧洲放射治疗和肿瘤学会（ESTRO）做出一项重要决定即：寻找影响患者正常组织和肿瘤放射敏感性的遗传学因素，这项计划就是GENEPI（genetic pathways for the prediction of the effects of irradiation）。 放射线主要对细胞的DNA起作用。目前很多肿瘤细胞系研究显示，如果肿瘤细胞表达野生型的p53基因，当发生DNA损伤时可以最大程度的诱导细胞凋亡，敏感性增高。而p53基因在肿瘤组织中突变的几率很高，p53突变的细胞也并没有完全丧失诱导产生凋亡的能力，只是这方面的功能减弱。细胞可以通过启动非p53依赖的DNA损伤诱导凋亡信号通路来产生凋亡。其同源类似基因p73与p53蛋白具有非常相似的结构和功能，所以p73被认为是一个候选抑癌基因。DNA损伤-ATM-p73-细胞凋亡通路存在可能可以解释p53功能缺失时肿瘤细胞仍对抗肿瘤治疗具有敏感性。 在哺乳动物中，对DNA损伤进行反应的细胞周期调控通路最早是在AT细胞中观察到的。毛细血管扩张-共济失调突变基因（ataxia-telangiectasia mutated，ATM）是在细胞DNA双链损伤修复时具有启动效应的基因，ATM基因编码一种主要分布于增值细胞核内的蛋白激酶，该蛋白羧基端的400个氨基酸与PI3K（磷脂酰基醇3-激酶）的催化功能域具有高度的同源性。ATM蛋白通过磷酸化不同细胞周期的不同靶蛋白来调控细胞周期关卡，在DNA损伤识别信号传导及修复、凋亡、染色体稳定性方面具有重要作用。ATM识别，ATM激酶在体内能被DNA损伤（DSBs）所激活，通过磷酸化和去磷酸化一系列蛋白底物等参与调控细胞周期和对损伤DNA的修复。ATM基因发生突变，缺乏细胞周期关卡和DNA修复功能失常，细胞凋亡率升高，表现为对放射线敏感。 在分子水平检测肿瘤放射敏感性可以采用：1）DNA分析预测肿瘤放射敏感性；2）RNA分析预测肿瘤放射敏感性；3）蛋白质分析预测肿瘤放射敏感性。是蛋白质的结构和功能最终直接影响着生命活动的变化，基因转录水平的研究只能在一定程度上反映基因表达产物的变化，而真正发挥功能的蛋白要经过转录后加工、翻译调控以及翻译后加工等许多步骤和调控才能形成，因而对蛋白质的直接研究才能真实解释各种生命现象。在蛋白水平上预测肿瘤放射敏感性，可以采用免疫组化、Western blot等定性或半定量的方法检测单个或几个基因来预测放射敏感性。 通过对肿瘤细胞内在放射敏感性的预测来推测个体肿瘤放射治愈可能性是临床肿瘤学长期探索而尚未解决的问题，本实验采用免疫组化的方法，观察放疗敏感组及放疗抗拒组宫颈癌患者肿瘤组织中ATM及p73α基因的蛋白表达水平与放射敏感性的关系，以进一步应用分子生物学技术预测宫颈鳞癌放射敏感性，为个体化治疗提供依据，使预测肿瘤放射敏感性的方法将更加灵敏、稳定，更加简便、快速；并为放射增敏治疗提供一种新的策略。 目的: 采用免疫组化的方法，观察放疗敏感组及放疗抗拒组宫颈鳞癌患者肿瘤组织中同一信号通路ATM及p73α基因的表达水平，研究两种蛋白的表达水平与患者放射敏感性、预后的关系，探讨两者表达水平的关系，评价其作为分子生物学水平标志物预测宫颈鳞癌放射敏感性的可能性，为个体化治疗提供依据；并为放射增敏治疗提供一种新的策略。 方法: 免疫组织染色方法标本经10％多聚甲醛固定，常规脱水，石蜡包埋，4μm连续切片。采用免疫组化技术（SP法），按试剂盒说明书的操作步骤进行，观察84例宫颈鳞癌患者组织的ATM、p73α的表达情况。 结果: 1.ATM、p73α蛋白表达ATM、p73α蛋白表达阳性率分别为50．0％、33．3％。ATM阳性反应呈现于胞浆和胞核，胞核内为主；p73α为胞核着色。 2.ATM、p73α蛋白表达与放疗疗效的关系放疗敏感组中P73α蛋白阳性率高于放疗抗拒组（P<0．05）。而放疗抗拒组中ATM蛋白阳性率高于放疗敏感组（P<0．05）。表明在这两组具有不同放射敏感性的患者宫颈鳞癌组织中ATM、p73α蛋白的表达是有差别的。提示放射抗拒性可能与ATM蛋白表达水平高有关。放射敏感性可能与p73α蛋白表达水平高有关。 3.生存分析显示，p73α、ATM蛋白对宫颈鳞癌患者的预后具有预测价值：P73α蛋白阳性的患者无复发生存时间明显长于ATM蛋白阳性，预后较好，（P<0．05）。 4.在宫颈鳞癌病例中，高表达P73α者一般ATM蛋白表达低，两者呈现负相关（R=0．303），提示两种蛋白对放射线引起的生物效应具有不同的作用。 结论: ATM与p73α蛋白在细胞中的分布与ATM蛋白能够识别DNA损伤、参与一系列核内磷酸化反应，P73α蛋白诱导细胞凋亡的功能有关。 1.ATM与p73α蛋白在宫颈鳞癌中的表达负相关：p73α高表达病例中ATM蛋白一般表达水平低； 2.ATM蛋白表达水平高者对放射线敏感性低，p73α蛋白高表达者对放射线敏感性高，提示两种蛋白的表达水平或许可以成为宫颈鳞癌放射敏感性及预后的预测指标，ATM-ATR-CHK-E2F1-p73信号通路在诱导放射线引起的宫颈鳞癌细胞凋亡中具有重要意义。 3.应用免疫组化法检测p73α、ATM在宫颈鳞癌组织中的表达来预测宫颈鳞癌放射敏感性和预后，简便易行，费用不高，有实用价值。

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结论

参考文献

附录

综述 肿瘤细胞凋亡与放射敏感性

攻读学位期间的研究成果

致谢