乙型肝炎病毒拉米夫定耐药突变及其基因型的研究

摘要

研究背景： 乙型肝炎病毒感染在世界范围广泛流行，仅慢性HBV携带者就有近4亿人之多。HBV感染不仅可导致急、慢性病毒性肝炎，而且还可发展为肝硬化及肝细胞癌，每年导致大约100万人死亡，严重影响了人类的健康。拉米夫定是一种脱氧胞嘧啶核苷类似物，它可以明显抑制HBV的复制从而减少病毒的总负荷量。但是，应用该药6个月以上，HBVP基因区YMDD基序即酪氨酸(Y)-蛋氨酸(M)-天门冬氨酸(D)-天门冬氨酸(D)中204位蛋氨酸(M)被缬氨酸(V)或异亮氨酸(Ⅰ)取代，生成YVDD、YIDD或YSDD，从而产生耐药性。在204位密码子发生突变的同时常会出现180位密码子的联合突变。拉米夫定耐药后会使病人血清DNA升高，甚至使病人的病情恶化。近年研究发现，HBV基因型的类别与HBV的感染途径、自然史、临床表现、药物疗效、病毒变异以及疾病进展有关。到目前为止，根据HBV核苷酸全序列异质≥8％或表面抗原S基因序列核苷酸差异度≥4％，已将乙肝病毒株分为A到H8种基因型。由于不同基因型的HBV在流行特征、致病性、对药物治疗反应等方面存在差异，因此了解HBV基因型具有重要的临床意义。 目前，用于检测乙肝病毒拉米夫定耐药突变的方法主要有：(1)直接测序法，该方法一直被认为是检测基因突变的金标准；(2)限制性片段长度多态性分析(RFLP)技术，即利用限制性内切酶对DNA特定序列专一性识别并进行切割的特点，对目的DNA进行酶切，则不同的序列就会被切割成长短不一的DNA片断，再通过凝胶电泳观察酶切结果，然后对酶切图像进行多态性分析来确定基因的突变情况；(3)基因芯片技术；(4)聚合酶链反应微板核酸杂交-酶联免疫黏附法聚合酶链反应微板核酸杂交-酶联免疫黏附法法是一种将基因扩增、核酸杂交和酶联显色3种诊断技术为一体的检测技术；(5)实时荧光定量PCR；(6)变性高效液相色谱(DHPLC)。 用于乙肝病毒基因分型的方法有：(1)HBV全基因测序，是HBV基因分型的金标准；(2)表面抗原S基因序列测定，以上这2种方法均需时费力、较为繁琐，不适合流行病学调查；(3)表面抗原S基因聚合酶链反应-限制性片断长度多态性分析；此方法灵敏度较高、特异性较强，能较准确地鉴定HBV基因型，可用于HBV基因型的流行病学调查，但步骤较繁杂、易受污染、酶切位点易受基因变异的影响；(4)HBV基因型特异性表位单克隆抗体免疫吸附法。本法对于不同基因型混合感染或基因型特异性表位存在点突变时不能分型，同时需要建立一套单克隆抗体；(5)HBV基因型特异性引物PCR；(6)酶联免疫吸附法该方法杂交时间短、分型较可靠、自动化程度高，可大规模进行HBV基因分型。但是，该方法测定中影响因素较多，而且其操作中有一定的技术要求，在临床检验中除正常反应外，有时常可见到一些错误结果，即假阳性或假阴性结果。(7)基因芯片技术该技术用于乙型肝炎病毒的基因分型检测有很多潜在的优势，但在实现过程中还有许多需待解决的问题。 研究目的： 优化RFLP，实时荧光PCR和变性高效液相色谱三种检测方法用于乙肝病毒拉米夫定耐药突变检测和乙肝病毒基因分型，并对三种方法的检测结果进行比较、评估，确定能快速、准确、稳定、适用于临床的针对乙肝病毒耐药突变和对乙肝病毒进行基因分型的检测方法。 通过将检测结果与临床资料进行对比分析，进而探索乙肝病毒拉米夫定耐药突变、基因亚型与临床的相关性。 研究方法： 1.RFLP检测乙肝病毒拉米夫定耐药突变及对乙肝病毒进行基因型分析：首先，根据blast比对分析和相关文献报道设计突变引物和基因分型的引物；然后，优化最佳酶切体系；最后，将PCR纯化产物进行琼脂糖电泳，凝胶成像系统下观察酶切结果，进而确定乙肝病毒拉米夫定耐药突变情况并确定乙肝病毒基因型。 2.实时荧光PCR方法检测乙肝病毒拉米夫定耐药突变并对乙肝病毒进行基因分型：首先，根据乙肝病毒拉米夫定用药突变位点设计7对突变检测引物，用于乙肝病毒拉米夫定耐药突变的检测；乙肝病毒分为A-H8种基因型，我国主要是B，C，D三种基因型，因此设计主要用于检测B，C，D三种基因型的引物设计；然后，采用SYBRGreenI染料法并结合touch-down程序优化实时荧光PCR反应进行乙肝病毒的突变检测和乙肝病毒基因分型，为了提高检测结果的准确性采用△Ct值进行检测结果的判断。 3.变性高效液相色谱方法检测乙肝病毒拉米夫定耐药突变并对乙肝病毒进行基因分型：首先，设计用于DHPLC检测乙肝病毒突变的单碱基延伸引物和用于DHPLC进行乙肝病毒基因分型的多重PCR引物；然后优化单碱基延伸反应条件和多重PCR反应条件；检测乙肝病毒拉米夫定耐药突变时先进行单碱基延伸反应，然后将PCR产物纯化，纯化后的产物在完全变性的条件下进行DHPLC分析，即在DNA片段单链状态下将不同长度的片段分离，然后根据不同的色谱峰确定不同的突变类型。DHPLC进行乙肝病毒基因分型时，先将乙肝病毒DNA进行多重PCR扩增，然后将PCR产物直接在柱温均为50℃，即在非变性条件下进行DHPLC分析，根据不同长度DNA滞留Sep柱时间的不同，将不同长度的片段分离。根据形成的不同的色谱峰来确定不同的基因型。 研究结果： 1.RFLP方法检测211例血清标本，其中116例来自服用拉米夫定6个月以上的患者，在这116例标本中检测到含有不同突变类型的乙肝病毒：含有M204I、M204V、M204I+M204V、M204+M204I、M204+M204V、L180M、L180M+M204I、L180M+M204V突变型乙肝病毒的标本数分别是31例(26.7％)，24例(20.7％)，15例(12.9％)，11例(9.48％)，10例(8.62％)，13例(11.2％)，21例(18.1％)，17例(14.7％)。在服用拉米夫定少于6个月的21位患者血清中检测到有1例标本中含有M201I突变型乙肝病毒，在74例未曾接受过拉米夫定治疗的患者血清中，有1例标本中含有M201I突变型乙肝病毒。在211例标本中13例血清标本中含有B基因型的乙肝病毒，20例含有B、C混合型的乙肝病毒，其余的均为含有C基因型的乙肝病毒。 2.实时荧光PCR方法检测乙肝病毒拉米夫定耐药突变和对乙肝病毒基因分型：优化出了实时荧光PCR进行乙肝病毒耐药突变检测和基因分型的反应条件，并确定了实时荧光PCR进行乙肝病毒耐药突变检测和基因分型的标准。在被检测的211例血清标本中，119(56.4％)例标本中含有野生型乙肝病毒，33(15.6％)例标本中含有M204I突变型乙肝病毒，20(9.5％)例标本中含有M204V突变型乙肝病毒，M204I+M204V混合突变型病毒存在于12(5.7％)例标本中，M204+M204I混合突变型病毒存在于14(6.6％)例标本中，13(6.2％)例标本中含有M204+M204V混合突变型乙肝病毒；含有L180M突变型乙肝病毒的标本数为18(8.5％)例，24(11.4％)和22(10.4％)例标本中分别含有L180M+M204I，和L180M+M204V混合突变型乙肝病毒。在211例标本中12例血清标本中含有B基因型的乙肝病毒，24例含有B、C混合型的乙肝病毒，其余的均为含有C基因型的乙肝病毒。 3.DHPLC方法检测乙肝病毒拉米夫定耐药突变和对乙肝病毒基因分型：优化出了单碱基延伸反应和多重PCR反应的条件，并优化了DHPLC进行突变检测和乙肝病毒基因分型的条件，采用变性高效液相色谱方法成功地进行乙肝病毒拉米夫定耐药突变检测和乙肝病毒基因分型，建立了乙肝病毒拉米夫定耐药突变和乙肝病毒基因型的标准色谱峰。 4.通过将检测结果与临床资料进行相关性分析，得出了乙肝病毒拉米夫定耐药突变和乙肝病毒基因型与临床的相关性：通过x2检验，乙肝病毒拉米夫定耐药突变与患者的性别、血清DNA水平、病毒基因型之间没有相关性(P＞0.05)，而乙肝病毒拉米夫定耐药突变与患者服用拉米夫定的时间长短有相关性(P＜0.05)，用药时间越长，发生突变的几率越大。乙肝患者服用拉米夫定后，180位点的突变和204位点突变具有相关性(P＜0.05)。 结论： 本课题通过对三种检测方法及其检测结果的比较、分析和评估认为：实时荧光PCR和DHPLC这两种实验方法更适于临床大规模检测乙肝病毒耐药突变及对乙肝病毒进行基因分型，并且DHPLC技术由于其独特的优点，在未来的基因检测中将发挥有越来越重要的作用，必将在基因多态性和基因分型方面占有更重要的地位。通过将检测结果与临床资料进行分析得出了乙肝病毒拉米夫定耐药突变和乙肝病毒基因型与临床的相关性。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：主要符号表

声明

研究生导师介绍

前言

一、乙型肝炎病毒基因组结构特点

二、乙型肝炎病毒突变

1.乙肝病毒的全基因组范围内突变

2.乙型肝炎病毒拉米夫定耐药突变

3.乙型肝炎病毒突变的临床意义主要表现在以下几个方面

三、乙型肝炎病毒基因型

1.基因型的分布

2.基因型与临床治疗的相关性

四、乙型肝炎病毒突变与基因型的检测方法

1.PCR基础上的检测

2.实时荧光PCR

3.高性高效液相色谱

4.展望

五、本课题的重点及解决的问题

第一章 乙型肝炎病毒拉米夫定耐药突变检测

一、RFLP方法检测乙肝病毒拉米夫定耐药突变

1材料和方法

2讨论

3结论

二、实时定量PCR方法检测乙肝病毒拉米夫定耐药突变

1材料和方法

2 实验结果

3讨论

4 结论

三、DHPLC检测乙肝病毒耐药突变

1材料和方法

3结果

4讨论

5结论

四、三种方法检测HBV拉米夫定耐药突变的结果比较分析

第二章 乙型肝炎病毒基因型检测

一、RFLP方法对乙肝病毒进行基因分型

1材料和方法

3讨论

4结论

二、定时荧光PCR方法对乙肝病毒进行基因分型

1材料和方法

2结果

3讨论

4结论

三、DHPLC进行乙肝病毒基因分型

四、三种方法对HBV进行基因分型的结果比较分析

第三章 乙型肝炎病毒耐药突变，基因型及其临床相关性分析

第四章 拉米夫定耐药及其基因型检测在临床治疗中的应用前景

小结

参考文献

综述：乙肝病毒YMDD基序变异的分子生物学检测方法

攻读学位期间取得的研究成果

致谢