真菌polyporus sp.MO5多糖抗肿瘤作用及其分子机制研究

摘要

现阶段寻找化学结构新颖、作用机制独特的新型抗肿瘤药物仍是抗肿瘤研究的热点，由于通过化学合成途径合成的抗癌药物步骤多、收率低、成本大，人们已经把注意力转移到微生物上，特别是自从1929年英国的微生物学家亚历山大·弗莱明发现青霉素并成功用于感染之后，微生物的代谢产物逐渐成为寻找新药的一个重要靶点，使得微生物成为创新药物的重要来源和天然宝库。现已发现许多微生物的生物活性成分具有抗肿瘤作用，这些生物活性物质有大分子活性物质多糖类和蛋白质类，小分子活性物质萜类、生物碱类、有机酸酯类，他们的作用机制多种多样，大部分都是作用于DNA、超微结构、拓扑异构酶和其他酶等。而真菌早在多年前的东汉末期，世界上第一部药物专著《神农本草经》中就记载了灵芝、茯苓、猪苓等真菌药物的药效；明代著名医学家李时珍在《本草纲目》中收载了20多种真菌的药效。现代研究表明，对肉瘤和艾氏癌抑制率达60％～100％的已知真菌有近300种，大多数真菌活性成分主要为真菌多糖。多糖类是一类天然大分子化合物，是由醛糖或酮糖通过甙键连接在一起的多聚物，广泛存在于动物细胞膜、植物和微生物细胞壁中，是构成生命的四大基本物质之一，具有多种生物活性。真菌多糖能够控制细胞分裂分化，调节细胞生长衰老，具有很强烈的抗肿瘤，抗病毒，抗炎，抗突变，抗凝血，抗衰老，抗溃疡，抗辐照，健胃护肝，降血脂，降血糖，抗血栓，提高免疫力等生物活性，已被开发成多种药物和功能性食品添加剂。由于无明显的毒副作用，无有毒代谢物的蓄积，且其代谢产物可以成为人体的营养物质，使多糖成为近年抗肿瘤研究的热点。且能显著提高癌症患者的生存质量，在肿瘤生物学治疗方面具有很好的应用前景。多孔菌是指菌盖背面具有非褶状特征的一类大型真菌，多生长于倒立腐木、枯木及树桩上，多孔菌科的大部分真菌有具有较高的药用价值，其抑制肿瘤和产生肿瘤抑制因子的能力早已引起人们重视。我国传统医药很早就有用多孔菌治疗癌症的记载。而随着现代药理与研究的不断发展，从多孔类真菌中发现了许多结构新颖且具有强烈抗肿瘤活性的化合物，为抗瘤新药的开发提供了丰富的先导化合物库。而多孔菌多糖作用于肿瘤的具体机制还尚未明确，仍需要进一步探查。
　　 白血病是源于造血系统干细胞水平的恶性克隆性疾病，又称“血癌”。其特征为白血病细胞在骨髓及其他造血组织中呈恶性、无限制地增生，浸润全身各组织和脏器，产生不同症状；现阶段主要治疗手段仍为化疗、放疗、造血干细胞移植治疗。但是他们的毒副作用严重影响了它们在临床的应用，使得高效、低毒、低成本的天然药物倍受关注。
　　 自从1992年英国科学家Hichman等首次提出将诱导肿瘤细胞凋亡作为肿瘤治疗研究的主要目标和手段以来，肿瘤治疗也从直接杀死肿瘤细胞的治疗向文明性的诱导细胞程序性自动死亡的治疗手段转变，诱导凋亡的抗肿瘤研究逐渐成为国际抗肿瘤研究的热点。
　　 而现阶段多糖类药物作为抗肿瘤药物未广泛应用于临床，如果能真正清楚多糖作用的具体分子机制，对多糖广泛应用于临床抗肿瘤提供了可能。
　　 目的：
　　 Polyporussp.M05是本实验室发现的一种多孔菌，通过预试验发现此种真菌的粗提多糖对多种肿瘤细胞和白血病细胞有抑制作用。故本实验研究此种多糖在体外对白血病细胞HL-60的增殖抑制和促凋亡作用，并探讨其分子机制，明确其诱导HL-60细胞凋亡的信号传导途径。同时检测多糖对小鼠骨肉瘤S180细胞的抑制作用，建立S180小鼠肿瘤模型，研究多糖的体内抗肿瘤作用和免疫增强作用。
　　 方法：
　　 经水和低浓度碱液煎煮，40％和80％乙醇沉淀后从多孔菌Polyporussp.M05子实体中提取到4种粗多糖，分别为APS-1,APS-2，APS-3和APS-4。将4种多糖作用于HL-60细胞，用MTT实验测定不同浓度多糖对细胞增殖的影响，并筛选适宜的多糖浓度建立细胞凋亡模型，流式细胞术分析细胞周期及凋亡率，RT-PCR方法检测凋亡相关基因。
　　 MTT法检测多糖APS-3体外对S180细胞的增殖抑制作用。皮下注射S180细胞建立小鼠肿瘤模型，每日灌胃给予多糖APS-3,记录荷瘤小鼠体重并测量肿瘤体积。2周后处死小鼠，称量小鼠脾脏和肿瘤重量，检测NK、LAK细胞活性，采用HE染色对肿瘤切片进行病理学观察，采用TUNNEL法检测肿瘤细胞凋亡情况。
　　 结果：
　　 APS以时间及剂量依赖方式抑制HL-60细胞增殖，与阴性对照组比较，不同浓度的APS对HL-60细胞均产生增殖抑制作用。作用72h时，四种糖较低浓度APS-10.125mg/1,APS-20.25mg/1,APS-350μg/1,APS-42.5μg/1的抑制率分别为75.7％，62.2％，75％，69％。流式细胞术检测细胞周期，APS-2，APS-4诱导HL-60细胞72h后可观察G0/G1期细胞百分比明显升高，G2/M期细胞百分比明显降低，APS-3未见明显周期细胞变化。1mg/ml的APS-1处理HL-60细胞24h和48h后Bax、Fas、Caspase9基因表达升高，Bcl-2、c-Myc表达无明显变化。1mg/ml的APS-2处理HL-60细胞24h和48h后Bax、Fas、Caspase9表达升高，c-Myc基因表达降低，Bcl-2表达无明显变化；200μg/1的APS-3处理HL-60细胞24h和48h后Bax、Fas、Caspase9表达升高，c-Myc基因表达降低，Bcl-2表达无明显变化；17μg/1的APS-4处理HL-60细胞24h和48h后Bax、Caspase9表达升高，Fas、Bcl-2、c-Myc表达无明显变化。
　　 40μg/ml的APS-3在体外作用24h后对S180细胞有抑制作用，且随着浓度的增加抑制作用增强。与模型对照组相比，多糖APS-3处理组小鼠肿瘤质量下降，而抑瘤率增高，且随着浓度的增大，抑瘤率增高。小剂量APS-3对肿瘤的抑制率即达到33％，中剂量达80.22，高剂量APS-3对肿瘤的抑制率高达85.47％。大、中、小剂量的多糖APS-3均能提高荷瘤鼠NK细胞杀伤活性，但小剂量组提高尤为明显。小剂量组APS-3能明显提高荷瘤小鼠的LAK细胞的活性，促进LAK细胞杀伤靶细胞P815细胞。HE染色后可见多糖治疗组小鼠肿瘤组织中可见大片坏死无结构区域，瘤细胞已完全溶解，有肉芽组织形成。TUNNEL检测肿瘤切片未见明显凋亡。
　　 结论：
　　 从Polyporussp.M05子实体中提取到的四种多糖均可抑制HL-60细胞生长，诱导细胞凋亡。APS-1和APS-4可引起细胞G0/G1期阻滞。四种糖均可引起凋亡基因Caspase3和Bax的表达增强。多糖APS-1、2、3均可引起Fas基因表达升高，但多糖APS-4作用后，Fas基因表达无明显变化。Polyporussp.M05多糖对白血病细胞HL-60的抑制作用是通过引起细胞周期阻滞，上调促凋亡基因的表达，下调抑凋亡基因的表达诱导细胞凋亡实现的。内源性途径和外源性途径均参与了多糖诱导的HL-60细胞凋亡过程，但4种多糖引起凋亡的具体信号传导途径并不完全相同。
　　 多糖APS-3对荷S180小鼠的体内治疗效果显著，抑瘤率高达80％以上。经APS-3治疗后，小鼠的NK和LAK细胞杀伤活性均显著提高，但TUNNEL检测并未见病理切片中有大量细胞凋亡。可能APS-3在体内主要是通过增强小鼠免疫功能，提高小鼠自身免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤活性，从而抑制肿瘤发展，最终实现抗肿瘤活性的。

目录

文摘

英文文摘

研究生导师及课题小组成员简介

主要符号说明

前言

材料及试剂仪器

1 材料

2 实验仪器

3 试剂和药品

实验方法

1 多糖APS体外诱导HL-60细胞凋亡的作用及机制研究

1.1 多糖APS的制备

1.2 多糖对HL-60细胞增殖的影响

1.3 细胞凋亡模型的建立

1.4 细胞形态学观察

1.5 多糖对HL-60细胞周期及凋亡检测

1.6 多糖对HL-60细胞凋亡相关基因的调节作用

2 多糖APS体内抑制小鼠肉瘤的作用研究

2.1 APS-3体外对S180肉瘤细胞的抑制作用

2.2 S180肉瘤荷瘤小鼠模型及治疗模型建立

2.3 APS-3对荷瘤小鼠S180肉瘤生长抑制作用

2.4 APS-3对荷瘤小鼠免疫细胞活性的影响

2.5 APS-3作用前后小鼠肉瘤的病理学检查

3 统计学处理方法

实验结果

1 四种多糖APS对HL-60细胞增殖的影响

2 四种多糖作用于HL-60后细胞形态学观察

3 四种多糖作用于HL-60后对细胞周期及凋亡率影响

4 四种多糖作用于HL-60后各凋亡相关基因在mRNA水平表达变化

5 APS-3体外对S180细胞的作用

6 APS-3对荷瘤小鼠S180肉瘤生长的抑制作用

7 APS-3对荷瘤小鼠S180瘤重及抑制率的影响

8 APS-3对荷S180瘤小鼠免疫活性的影响

9 病理学观察APS-3对肿瘤细胞的杀伤作用

讨论

结论

展望

参考文献

[综述]灵芝提取物抗白血病细胞作用机制的研究进展

参考文献

[攻读硕士学位期间发表论文]

[致谢]