抑制C35基因表达介导乳腺癌细胞凋亡及相关信号通路的研究

摘要

乳腺癌是严重危害女性健康的重要疾病之一，据调查数据显示，全球每年120万妇女罹患乳腺癌，并有50万死于该病。在西欧、北美等发达国家，乳腺癌的发病率占女性恶性肿瘤首位。传统的治疗方法，如手术、化疗、放疗等，尽管取得了一定的治疗效果，但或多或少给女性患者身体带来伤害，特别是年轻的女性患者。近年来随着对肿瘤细胞生长、增殖、凋亡等分子机制的深入研究和探讨，现代肿瘤的治疗已进入生物治疗时代，特异性靶向治疗肿瘤已成为可能。RNA干扰技术是近年来发展起来的新技术，它是通过siRNA介导的特异性高效抑制基因表达途径，由siRNA介导识别并靶向切割同源性靶基因mRNA，进而抑制目的基因的表达，实现肿瘤细胞的逆转，一些针对siRNA技术筛选的靶基因的药物已进入动物实验阶段。因此利用siRNA技术研究肿瘤细胞中特异性靶基因功能，并进行相关药物的研究已成为肿瘤基因治疗的新的研究方向。 C35基因是近年来发现的在乳腺癌细胞中特异性高表达的基因，研究表明60％以上的乳腺癌患者检测到C35基因过度表达，明显高于已进行广泛研究和探讨的乳腺癌特异性高表达HER-2/neu基因。研究证实，在Ⅱ/Ⅲ级乳腺癌患者中34％的C35和HER-2/neu基因均有高表达，31％的C35基因高表达而HER-2/neu基因为阴性，所有HER-2/neu基因高表达的病例均有C35基因高表达，但尚未检测到HER-2/neu基因表达阳性而C35基因表达阴性的乳腺癌病例，说明C35基因在乳腺癌细胞的激活高表达更常见、范围更广，其功能可能与乳腺癌的发生、发展关系更为密切。 本实验针对C35基因的编码区设计并筛选了两对siRNA，成功构建了C35基因的siRNA重组转录载体psiRNA-C35-1和psiRNA-C35-2。转染乳腺癌细胞株T47D72h后，通过RT-PCR和Westernblot检测重组质粒载体对乳腺癌细胞基因表达的影响，RT-PCR结果表明转染质粒pTZU6+1、psiRNA-C35-1和psiRNA-C35-2组的相对表达率分别是转染对照组（脂质体组）的95.3％、40％和28.4％；Westernblot结果显示，以转染脂质体组的蛋白带为标准，其它组与之比较，转染质粒pTZU6+1、psiRNA-C35-1和psiRNA-C35-2组的相对表达率分别是转染对照组（脂质体组）的94.9％、29.6％和32.2％。通过RT-PCR和Westernblot检测到重组质粒psiRNA-C35-1和psiRNA-C35-2能够明显抑制C35基因表达。通过MTT法检测细胞增殖情况，结果表明重组质粒能够抑制乳腺癌细胞的增殖。采用AnnexinⅤ法进行细胞凋亡检测，结果发现转染pTZU6+1和脂质体组的凋亡为21.6％和18.5％，而转染重组质粒的分别为33.7％和44.9％。应用Tunel检测siRNA作用后肿瘤细胞的凋亡变化，结果显示siRNA作用的实验组肿瘤细胞的凋亡细胞数远远高于对照组，说明抑制C35基因表达能明显介导乳腺癌细胞的凋亡。应用Westernblot检测C35基因作用后相关信号分子变化，结果显示，单独转染重组质粒psiRNA-C35的乳腺癌细胞中Caspase-3表达明显强于对照组，说明抑制C35基因表达可激活信号分子Caspase-3，进而激活Caspase细胞凋亡信号通路，初步探讨了C35基因在乳腺癌细胞中的作用机制。 总之，本研究首先设计、合成、制备了C35基因的siRNA，构建siRNA重组载体，并通过脂质体转染乳腺癌细胞，证实C35基因的siRNA能明显抑制乳腺癌细胞内C35基因的表达，进而介导乳腺癌细胞的凋亡，其在肿瘤细胞中的作用可能是通过抑制Caspase信号通路阻止细胞凋亡的，此实验的结果将为肿瘤的基因治疗提供了新的思路和药物靶点。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：主要符号表

声明

前言

第一部分siRNA载体的构建及鉴定

一、材料和方法

二、结果

三、讨论

第二部分siRNA抑制乳腺癌细胞C35 基因的表达

一、材料和方法

二、实验结果

三、讨论

第三部分 抑制C35 基因表达介导乳腺癌细胞凋亡及其相关信号通路的研究

一、材料和方法

二、实验结果

三、讨论

小结

参考文献

综述：诱导型siRNA技术及其应用研究进展

攻读学位期间的研究成果

致 谢