抑制肿瘤细胞增殖诱导配体APRIL表达的抗肿瘤研究

摘要

目的： 增殖诱导配体(aproliferation-inducingligand，APRIL)属肿瘤坏死因子(tumornecrosisfactor，TNF)超家族成员之一，在正常组织中表达很弱，其主要功能为调节淋巴细胞增殖和体液免疫反应。但近年发现其在多种肿瘤细胞和肿瘤组织中却有高水平表达，并且异位表达的APRIL具有促进肿瘤细胞增殖、抑制肿瘤细胞凋亡、促进血管内皮细胞生长和诱导新生血管生成等作用，与肿瘤的发生发展相关。因此深入研究APRIL分子的作用机制及其抑制剂的筛选，可为APRIL高表达相关的多种肿瘤治疗提供新型候选制剂和药物设计的新靶标。本课题组多年来研究中药单体、生物制剂和化疗药对肿瘤细胞的免疫修饰作用，并且在诱导肿瘤细胞分化和凋亡方面取得一定成果。在此基础上，本研究将中药单体淫羊藿苷(icarrin，ICA)、黄芩苷(baicali，BAI)联合化疗药物多柔比星(doxorubicin，又称ADM)作用于人肝癌HepG2细胞，采用MTT、RT-PCR以及免疫组化等方法从细胞、分子、基因水平探讨这些药物抑制HepG2细胞中APRIL以及bcl-2、VEGF的表达，进而抑制肿瘤细胞增殖、逆转肿瘤细胞免疫逃逸和抑制血管内皮细胞生长的作用及机制，为这些中药单体联合化疗药的临床抗肿瘤应用提供实验依据。 方法： 1.MTT法检测25μg/mlICA、200μg/mlBAI、2μg/mlADM以及12.5μg/mlICA+1μg/mlADM、100μg/mlBAI+1μg/mlADM5个药物处理组与未用药对照组HepG2细胞的增殖活性；CD3AK细胞对5个用药处理组和未用药对照组HepG2细胞的杀伤活性；5组药物作用后的HepG2细胞培养上清与未用药处理的HepG2细胞培养上清相比，对血管内皮细胞ECV304增殖的影响。 2.RT-PCR法检测APRIL及其受体HSPG在HepG2细胞中的表达情况；经5组药物处理后HepG2细胞APRIL以及凋亡相关基因bcl-2表达水平的变化；经CD3AK作用后，HepG2细胞中bcl-2表达水平的变化；APRIL的相应受体HSPG在ECV304细胞中的表达情况。 3.免疫组化检测经5组药物处理后，与未用药对照组相比，HepG2细胞中血管内皮细胞生长因子VEGF表达水平的变化。 结果： 1.不同质量浓度的ICA、BAI以及ADM作用48h后，对HepG2细胞具有增殖抑制作用，其中ICA25μg/ml，BAI400、200、100μg/ml，ADM16、8、4、2μg/ml组与未用药对照组(0μg/ml)相比，增殖抑制作用明显(P＜0.01)。 2.25μg/mlICA、200μg/mlBAI、2μg/mlADM、12.5μg/mlICA+1μg/mlADM以及100μg/mlBAI+1μg/mlADM5个用药处理组与未用药对照组(0μg/ml)相比，对HepG2细胞具有明显的增殖抑制作用，且ICA、ADM、ICA+ADM、BAI+ADM组的增殖抑制作用呈明显的时间依赖性，96h抑制率最高，抑制率分别为(29.30±6.62)％、(63.60±1.35)％、(99.03±0.10)％、(98.89±0.18)％(均为P＜0.05)。 3.APRILmRNA及其受体HSPGmRNA在HepG2细胞呈高水平表达。 4.5个用药处理组HepG2细胞APRIL基因mRNA与未用药对照组相比，表达减少，相对定量值由对照组的0.71分别降至0.69、0.68、0.47、0.43、0.42。 5.5个用药处理组HepG2细胞bcl-2基因mRNA与未用药对照组相比，表达减少，相对定量值由对照组的0.98分别降至0.77、0.79、0.81、0.70、0.69。 6.CD3AK对5个用药处理组的HepG2细胞在效靶比为12.5:1时，24h杀伤率分别为(97.23±5.11)％、(93.12±9.88)％、(60.45±5.71)％、(43.87±8.2)％、(47.25±2.68)％明显高于对照组的(30.00±4.50)％(均为P＜0.01)。 7.CD3AK与5个用药处理组的HepG2细胞作用后，HepG2细胞bcl-2mRNA表达相对定量值，对照组由0.98降至0.85，5个用药组由对照组的0.85分别降至0.65、0.74、0.51、0.65、0.61，与CD3AK作用前相比，HepG2细胞bcl-2mRNA的相对表达值进一步明显下降。 8.免疫组化结果显示，与未用药对照组相比，HepG2细胞经5个用药组处理后，VEGF的表达明显下降。 9.HepG2细胞经5个用药组处理48h后，另加新鲜培养液培养48h的上清与未用药处理的对照组上清相比，对ECV304细胞具有明显的增殖抑制作用，抑制率分别为(2.79±5.57)％、(15.20±3.79)％、(12.10±4.50)％、(19.34±8.17)％、(20.27±4.77)％(均为P＜0.05)。 10.APRIL受体HSPGmRNA在ECV304细胞中呈高表达。 结论： 1.APRIL及其受体HSPG在HepG2细胞中呈高水平表达，APRIL可能是以自分泌形式作用于自身受体HSPG发挥其促肿瘤细胞增殖的活性。 2.ICA、BAI联合ADM在降低APRILmRNA和凋亡相关基因bcl-2mRNA表达水平的同时，显著抑制HepG2细胞增殖活性，表明其下调APRIL、bcl-2mRNA表达水平可能是其抑制肿瘤细胞增殖的相关机制。 3.ICA、BAI联合ADM处理后的HepG2细胞，对CD3AK细胞的杀伤敏感性增强，逆转肿瘤细胞的免疫逃逸作用。并且，CD3AK作用后，HepG2细胞bcl-2mRNA的表达水平进一步明显下降，表明CD3AK的杀伤机制与下调靶细胞的bcl-2mRNA表达水平有关。 4.HepG2细胞内VEGF呈高水平表达；血管内皮细胞ECV304内APRIL受体HSPG呈高水平表达，表明HepG2细胞所产生的VE6F、APRIL可能是以旁分泌形式直接作用于血管内皮细胞上的相应受体，发挥其促进血管内皮细胞增殖活性。 5.ICA、BAI联合ADM降低HepG2细胞中APRIL与VEGF的表达水平，从而发挥其抑制血管内皮细胞ECV304生长的作用。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：主要符号表

声明

硕士研究生导师及课题小组成员简介

前言

材料与方法

1实验材料

2实验方法

2.1 MTT法检测ICA、BAI联合ADM对HepG2细胞增殖的影响

2.2 MTT法检测ICA、BAI联合ADM对HepG2细胞增殖动力学的影响

2.3 RT-PCR法检测HepG2细胞APRILmRNA及其受体HSPGmRNA的表达

2.4 RT-PCR法检测ICA、BAI以及ADM处理后HepG2细胞APRILmRNA、bcl-2mRNA表达变化

2.5 MTT法检测ICA、BAI联合ADM处理后HepG2细胞对CD3AK细胞的杀伤敏感性变化

2.6 RT-PCR检测CD3AK细胞作用后，HepG2细胞凋亡相关基因bcl-2mRNA水平的变化

2.7免疫组化检测ICA、BAI联合ADM处理后HepG2细胞中VEGF的表达变化

2.8 MTT法检测药物作用后的HepG2细胞培养上清对静脉内皮细胞ECV304增殖的影响

2.9 RT-PCR法检测ECV304中APRIL受体HSPG的表达情况

3统计学处理

结果

1 ICA、BAI以及ADM对HepG2细胞增殖的影响

2 ICA、BAI联合ADM对HepG2细胞增殖动力学的影响

3 APRILmRNA及其受体HSPGmRNA在HepG2细胞的表达

4 ICA、BAI以及ADM处理后HepG2细胞APRIL mRNA、bcl-2 mRNA表达变化

5 ICA、BAI联合ADM处理后HepG2细胞对CD3AK杀伤敏感性的变化

6 CD3AK作用后，HepG2细胞凋亡相关基因bcl-2mRNA水平的变化

7药物作用后的HepG2细胞培养上清对静脉内皮细胞ECV304增殖的影响

8 ICA、BAI联合ADM处理后HepG2细胞中VEGF的表达变化

9 APRIL的受体HSPGmRNA在ECV304细胞中的表达

讨论

1 APRIL及其促肿瘤细胞增殖的作用机制

2 ICA、BAI联合ADM降低HepG2细胞中APRILmRNA的表达与抑制肿瘤细胞增殖

3 ICA、BAI联合ADM降低HepG2细胞中凋亡抵抗基因bcl-2的表达与抑制肿瘤细胞增殖

4 ICA、BAI联合ADM提高HepG2细胞对CD3AK细胞的杀伤敏感性,逆转肿瘤细胞的免疫逃逸作用

5 HepG2细胞旁分泌APRIL和VEGF促进血管内皮细胞生长的作用机制

结论

参考文献

增殖诱导配体APRIL及其在肿瘤发生发展中的作用

凋亡抑制因子FAP-1与肿瘤的关系

攻读学位期间的研究成果

致谢