TGFBI及其R124位突变体的构建及在角膜营养不良分子发病机制方面的应用

摘要

目的：TGFBI突变是导致人类多数角膜营养不良的因素，但具体的分子和细胞机制尚不清楚。本研究构建对应于人类野生型TGFBI及R124三个常见突变体的小鼠TGFBI真核表达载体，为采用实验研究手段探讨TGFBI突变致病的机制奠定基础。 方法：1、TGFBI基因的克隆：提取小鼠正常角膜组织总RNA，经反转录－PCR合成TGFBI野生型，利用重叠区扩增基因拼接法（gene SOEing）先分别扩增R124C、R124H、R124L突变的两个片段380bp和1720bp，然后两个片段共同变性退火延伸连接为TGFBI-R124C，TGFBI-R124H，TGFBI-R124L全长，TGFBI野生型及三个突变分别克隆至真核表达载体pcDNA3．1中，转化H5a菌株，提取质粒，进行限制性内切酶鉴定和测序分析。将TGFBI及其突变基因连入逆转录病毒载体pMSCV中，用包装细胞PT67包装病毒质粒，并收集病毒上清准备感染动物。2、TGFBI表达载体的转染和表达：将重组真核表达质粒转染NIH3T3细胞进行表达，通过real time PCR及western blot检测TGFBI基因及蛋白在NIH3T3中的表达；培养小鼠角膜基质细胞和角膜上皮细胞，取正常2周龄小鼠眼球，用diapase酶消化后，剪下角膜层，撕去上皮层和内皮层，基质层用胶原酶消化后，离心、弃上清、DF-12重悬、接种到培养瓶中培养，用pcDNA3．1-TGFBI及其突变重组真核表达质粒转染小鼠角膜上皮TKE2和基质细胞，观察细胞的形态变化及real time PCR检测转染后TGFBI基因及相关功能基质基因和蛋白的表达变化。 结果：1、测序结果显示TGFBI野生型序列与PUBMED公布序列完全相同，同时R124三个突变体基因序列的突变位点与预期设定相同，TGFBI野生型及三个突变体以正确序列和方式插入载体pcDNA3．1和pMSCV，且无移码和错义。2、用包装细胞PT67成功包装了病毒载体pMSCV，并产生了具有侵袭能力的病毒颗粒，为下一步感染动物做好了准备。3、pcDNA3．1-TGFBI及其突变重组真核表达质粒转染NIH3T3，实时定量PCR和western blot结果显示TGFBI在NIH3T3细胞中基因和蛋白水平表达都明显增强，说明载体的构建是成功的，可以正确表达。4、pcDNA3．1－TGFBI及其突变重组真核表达质粒转染小鼠上皮细胞TKE2后，检测到TGFBI蛋白表达无明显增强，可能与转染效率不高有关。进一步用包装的pMSCV病毒颗粒感染TKE2，发现感染效率很高，但是细胞形态改变很大，考虑改用小鼠角膜基质细胞。5、pcDNA3．1－TGFBI及其突变重组真核表达质粒转染小鼠基质细胞后，real time PCR检测到TGFBI及突变基因表达明显增加，并且检测到胞外基质蛋白（extracellular matrix protein）ecml及晶体蛋白基因（crystalline）cryaa、cryba1、crybb2表达增加，同时基质金属蛋白酶（matrix metallopreoteinases mmps）mmp3、mmp13表达增加而同时其抑制剂基质金属蛋白酶组织抑制剂（tissue inhibitor of metalloproteinases timps）timp3及角膜基质重塑相关基因（matrix-remodelling associated7）mxra7表达减少。 结论：成功构建了小鼠TGFBI及其R124突变体的真核表达载体pcDNA3．1和逆转录病毒载体pMSCV，将逆转录病毒载体用包装细胞PT67包装，得到其病毒上清，为下一步感染动物做好准备。小鼠TGFBI及其R124突变体在NIH3T3和基质细胞中初步表达并改变部分相关基因的表达水平。为进一步实验研究TGFBI在角膜营养不良及其生理、病理功能奠定基础。

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前言

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

综述角膜营养不良与TGFBI基因突变的研究进展

附录

攻读学位期间取得的研究成果

致谢