双探针实时PCR快速检测结核杆菌利福平耐药基因突变的研究

摘要

目的： 结核病是对人类健康威胁最严重的传染疾病之一。与此同时由于结核杆菌耐药株出现的日益增加，使我们控制结核的能力大大减弱。利福平(RFP)是结核病化疗的基石，然而耐药结核杆菌的出现大大消弱了它的作用。据报道，约有90％的利福平耐药结核杆菌对其他多种抗结核药物也存在耐药。因此，对利福平耐药结核杆菌的研究成为了国内外学者关注的热点。 在结核病的治疗中，最初选择有效药物是关键，所以快速检测其敏感性或耐药性就变得非常重要。目前，对结核杆菌耐药性的诊断方法主要包括传统培养方法，由于结核杆菌特别是耐药的结核杆菌生长缓慢，传统的培养需要4-8周，这不利于疾病的及时治疗。在国内外的基因研究证实，多重药物耐药的原因在于药物作用区的基因编码逐步获得突变或药物代谢酶的产生。超过95％的耐利福平结核杆菌与其rpoB基因上的81bp核心区域突变有关。而对利福平敏感的结核杆菌在此区域没有突变发生。因此对这一基因的分析可以达到诊断RFP耐药的目的。随着分子生物学的发展，出现了一些新的方法，如：DNA测序法、PCR-SSCP法等。DNA测序法需要昂贵的仪器，限制了它的广泛应用。PCR-SSCP法不能确定突变位置和性质，并受实验条件的影响很大。总之，对结核杆菌耐药的诊断方法处于进一步完善和发展之中。 本课题选择的双探针实时PCR结合了MGB探针的特异和实时PCR快速灵敏的优点。MGB探针是近几年新发现的一种广泛用于单核苷酸突变的检测的技术，具有良好的稳定性和特异性。MGB探针在荧光定量分析中的优越性体现在：①理想条件下，与模板完全匹配的探针其Tm值应该稍微高于引物延伸的温度，而有单个碱基错配的探针其Tm值应该比引物延伸温度更低一些，MGB探针能满足这个条件。②MGB探针另一个显著特征是背景荧光低(在第一个循环的荧光)，这是由于MGB探针报告基团与淬灭基团的距离较短及在结构上具有其它更有效淬灭荧光的因素，所以背景值低。③MGB探针具有很好的敏感性和定量效果，不存在与高度复杂的DNA非特异性作用的问题。 以MGB探针为基础的实时定量PCR技术具备实验操作简便、费用低、时间短、结果可靠等其他方法无法比拟的特点，能快速准确的单基因位点的突变。我们采用这一技术检测结核杆菌rpoB基因突变，以期达到快速诊断结核杆菌RFP耐药，为临床提供及时有效的化疗指导。所以，双探针实时PCR快速检测结核杆菌利福平耐药技术的应用有着影响深远的临床意义。 方法： 一、实验对象： 本实验所用50例经临床确诊的结核病患者痰标本均来自聊城市传染病医院。H37Rv结核分枝杆菌标准敏感菌株购自北京生物制品检定所。药敏试验参照结核病诊断细菌学检验规程进行。 二、实验方法： 1、结核杆菌培养：采用改良罗氏培养基培养法进行。 2.对临床标本分离的结核杆菌标本用经典培养方法做利福平药敏试验。选择耐药菌株和敏感菌株。 3.我们通过DNABank检索结核杆菌rpoB基因库，得到rpoB基因的序列，利用oligo6Blast软件设计一对结核杆菌特异性引物。根据rpoB基因已知常见突变位点，包括：531位点、526位点、516位点、520位点、522位点设计出5条MGB探针和一条结核杆菌特异性探针。 4、提取培养产物的DNA，用MGB探针实时PCR方法检测结核杆菌rpoB基因点突变，分析其突变与RFP耐药的关系。 5、DNA测序检测结核杆菌rpoB基因突变位点。 结果： 一、50例临床标本用经典的结核杆菌培养方法培养后结果均呈阳性。 二、利福平药敏试验结果，50例标本中12株耐药，38株敏感。耐药率为24％。 三、MGB探针实时PCR方法检测结核杆菌rpoB基因突变，50例标本中有13例发生基因突变，突变率占26％；其中，利福平药敏试验检出的12株耐药菌株全部出现基因突变；38株敏感菌株中有一例出现基因突变；发生突变的13例标本中，有12例在531位点出现突变，突变百分率为24％，2例在526位点出现突变，突变百分率为4％，其中有一例发生了531、526双位点突变。 四、比较结果，50例标本中有13例发生了基因突变，突变率占26％；其中，12株耐药菌株全部出现基因突变，突变率达到了100％；38株敏感菌株有一例出现基因突变；发生突变的13例中，有12例是发生在531位点，2例发生在526位点，其中有一例发生了531、526双位点突变。通过与传统的利福平药敏试验结果比较，荧光实时PCR法的敏感性达100％。 五、DNA测序结果表明，MGB探针实时PCR方法检测的结核杆菌rpoB基因突变位点与DNA测序结果完全相符。 结论： 1.结核杆菌由于rpoB基因突变使RNA聚合酶表达发生改变致利福平耐药，其最常见的突变位点出现在531位点。 2.以MGB探针为基础的实时PCR技术可快速准确的检测结核杆菌rpoB基因位点的突变，达到快速诊断结核杆菌RFP耐药的目的，为临床提供及时有效的化疗指导。

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结论

参考文献

综述 结核分支杆菌利福平耐药的分子基础与检测技术

攻读硕士学位期间的研究成果

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