腺相关病毒转运的HDV核酶抑制HBV基因表达的初步研究

摘要

本课题组一直致力于研究反式作用HDV核酶对于乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）表达的工作，研究证实了HDV核酶作为HBV反义抑制剂的可行性，目前所需解决的是如何构建高效、安全、且具有靶向性的转移载体携带反式HDV核酶进入肝细胞内发挥作用，更接近于临床治疗途径。携带外源性治疗基因的转运载体是基因治疗的一个中心环节，决定着外源性治疗基因是否能够成功转运至靶细胞内，也影响着外源性治疗基因能否在细胞内高效的表达。 腺相关病毒（Adeno-associated virus，AAV）属于微小病毒科，依赖病毒属。AAV是一种可感染人类和一些其他灵长类动物的的小病毒。目前AAV不导致任何已知的疾病，因此这种病毒只引起非常轻微的免疫反应。AAV即可感染分裂期细胞也可感染非分裂期细胞，并可将其基因组整合入宿主细胞基因组中位于人19号染色体的特异位点（AAVS1）中。制备AAV基因治疗载体是需要剔除AAV基因组中的rep和cap区域，并将所需外源基因和能够启动其转录的启动子插入到两端的反向重复序列（inverted terminal repeats，ITR）之间，有助于单链DNA的载体转染的宿主细胞的DNA聚合酶作用下形成双链DNA时在宿主细胞核内形成多联体结构。腺相关病毒为基础的基因治疗载体在宿主细胞中主要以多联体形式存在与宿主细胞核中。腺相关病毒还具有非常低的免疫原性，似乎仅限于新一代的中和抗体，但它们诱导没有明确界定的细胞毒性反应。这些特点使得AAV成为备受瞩目的基因治疗潜在病毒载体。 HBV侵入肝细胞的机制是研究热点之一。自发现HBV PreS2多肽与聚合白蛋白的结合活性只限于人和黑猩猩的聚合白蛋白而证实肝细胞存在白蛋白受体以来，便认为HBV系借这种白蛋白受体同肝脏结合即侵入肝细胞。这种由HBV被膜抗原蛋白HBV DNA preS2所编码的聚合人血清白蛋白的受体（polymerized human serum albumin receptor，pHSA-R），又称HBV聚合白蛋白受体（HBVpAR）很可能具有HBV种特异性与脏器特异性，因而在HBV侵入肝细胞机制中起有基因的表达；探讨重组腺相关病毒的靶向性改造以及重组后腺相关病毒的包装制备方法。 研究方法: 重组有HDV核酶的腺相关病毒载体的构建：利用DNA重组技术将本课题组前期设计合成的反式作用HDV片段及其启动子U6一同构建入腺相关病毒载体pSNAV中，并在此载体中掺入EGFP荧光标记蛋白基因。 2、重组有HDV核酶的腺相关病毒载体抑制HBV基因表达：用阳离子脂质体法将带有绿色荧光蛋白标签的重组HDV核酶的腺相关病毒载体转染入表达HBV的肝癌细胞HepG2．2．15中，用Elisa方法检测其S抗原和E抗原的表达抑制作用。 3、重组有HDV核酶的腺相关病毒载体系统的构建：利用DNA重组技术将反式作用HDV片段及其启动子U6一同构建入腺相关病毒载体pAAV-IRES-hrGFP中。将肝细胞靶向性序列preS2构建入表达AAV壳体蛋白的控制质粒pAAV-RC中，并将AAV壳体蛋白中的感染相关R585、R588位点通过突变的方式封闭。 4、重组腺相关病毒的包装：将构建好的带有HDV核酶的结构质粒和靶向性改造后的控制质粒及辅助质粒共转染293T包装细胞，反复冻融方法收获重组腺相关病毒颗粒。然后感染肝癌细胞HepG2，检测包装效率。 研究结果： 1、经酶切鉴定和PCR鉴定，构建了分别含有针对HBV基因组C区和preS2区的反式作用HDV核酶的重组腺相关病毒载体pSNAV-CMV-EGFP-C-U6和pSNAV-CMV-EGFP-preS2-U6。 2、利用阳离子脂质体法将pSNAV-CMV-EGFP-C-U6和pSNAV-CMV-EGFP-preS2-U6质粒转染表达HBV的HepG2．2．15细胞，并用Elisa方法检测到其对HBV表达的抑制作用。pSNAV-CMV-EGFP-preS2-U6对HBeAg和HBsAg的抑制率约为29．53％和25％，pSNAV-CMV-EGFP-C-U6对HBeAg和HBsAg的抑制效果约为63．5％和50．07％， 3、经酶切鉴定和PCR鉴定，构建了重组入反式作用HDV核酶的pAAV-IRES-hrGFP-U6-CRZ和pAAV-IRES-hrGFP-U6-S2RZ结构质粒和重组入肝细胞靶向序列 preS2和AAV壳体蛋白靶向相关序列突变的控制质粒pAAV-RC-preS2-cap-A、pAAV-RC-cap-preS2-B、pAAV-RC-A585-588。 4、利用钙磷沉淀法和阳离子脂质体法将pAAV-IRES-hrGFP-U6-CRZ和pAAV-IRES-hrGFP-U6-S2RZ结构质粒和pAAV-RC-preS2-cap-A、pAAV-RC-cap-preS2-B、pAAV-RC-A585-588控制质粒及辅助质粒pHelper共转染包装细胞293T，收集包装出的重组腺相关病毒颗粒。 5、经倒置荧光显微镜观察，重组的腺相关病毒颗粒可感染肝癌细胞，但其感染效率偏低。 结论： 本实验构建了重组HDV核酶的腺相关病毒载体，在细胞水平上验证了腺相关病毒载体转运的反式作用HDV核酶可抑制HBV基因的表达。同时改造了AAV的壳体蛋白，使其带有靶向肝细胞的preS2序列，并通过基因突变封闭了其原有的感染相关位点，采用无辅助病毒的方法包装出了重组腺相关病毒颗粒，为进一步研究重组了靶向HBV基因组特定区域反式作用HDV核酶的重组腺相关病毒颗粒特异性感染肝细胞的研究建立基础。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:主要符号表

声明

前言

1 乙型肝炎病毒及乙型病毒性肝炎

2 HDV核酶在抗HBV基因治疗中的应用

3 重组腺相关病毒在基因治疗中的应用及其局限性

4 展望

5 本课题的研究重点

第一章重组HDV核酶的腺相关病毒载体及其抑制HBV基因表达的有效性

1 材料与方法

1.1 材料

1.2方法

2 结果

3 讨论

4 结论

第二章腺相关病毒载体介导的HDV核酶靶向转运系统的建立

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.2 实验方法

2 实验结果

3 讨论

4 结论

第三章转运HDV核酶的腺相关病毒的包装及和细胞感染

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.2 实验方法

2 实验结果

3 讨论

4 结论

全文小结

参考文献

综述重组腺相关病毒载体在肝疾病基因治疗中的应用及局限性

攻读学位期间发表的论文

致谢