角膜研究中实时定量PCR新内参基因的挑选与验证

摘要

目的：
　　 筛选可用于各种小鼠角膜疾病模型中实时定量PCR(qRT-PCR)分析时稳定表达的新内参基因。
　　 方法：
　　 利用Balb/c和C57BL/6小鼠建立6种角膜疾病模型，包括缝线、碱烧伤诱导的新生血管模型、真菌(白色念珠菌和烟曲霉菌)感染模型和贯通伤模型:在细胞模型中，构建真核载体质粒，用空载体和重组质粒分别转染原代培养的小鼠角膜基质细胞，正常细胞作为对照。通过前期在角膜新生血管模型的芯片结果中筛选出符合内参基因标准的8个候选基因(Psmb4, Cct4等)，然后利用qRT-PCR检测小鼠10种组织，各种角膜疾病模型及转染后基质细胞中8个候选内参基因、2个普遍应用的内参基因(GAPDH和ACTB)及1个目的基因(TKT)的表达含量，所得数据分别用geNorm和NormFinder软件进行分析。
　　 结果：
　　 QRT-PCR的结果显示在所有模型中10个内参基因没有一个能保持稳定表达。geNorm软件和NormFinder软件的分析结果推荐在不同的模型中使用不同的内参基因或内参基因组合，但是Cct4的表达总体上相对稳定，普遍使用的内参基因GAPDH和ACTB在所有的模型中都不稳定。另外，对于不同品系中的同种模型或者在同种品系中的不同模型，可能需要不同的内参基因作为标准。
　　 结论：
　　 芯片技术可以作为新内参基因的初步筛选方法，而qRT-PCR可以进一步检测初筛之后各个基因表达的稳定性。Cct4可能是一个新内参基因应用于qRT-PCR。要使RT-PCR的结果将更具有客观性，可能需要根据具体情况选择具体的内参基因或内参基因组合。