呼吸道合胞病毒的病毒样颗粒疫苗制备及其感染导致肺损伤机制研究

摘要

呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）是全球新生儿与老年人最为常见的呼吸道疾病病原之一。70％以上的RSV患儿是5岁以下的儿童，其中10％因下呼吸道感染（LRTI）而入院治疗。自上世纪60年代，全球科学家不遗余力地研制RSV疫苗，遗憾的是市场上至今没有认证的预防疫苗。由此，WHO要求世界各国做好防控RSV的工作。
　　1956年，Blount课题组首次发现黑猩猩鼻炎分泌物(CCA)的合胞病毒。第二年，Chanock等人报道CCA可感染婴幼儿及儿童引发支气管炎，并将CCA分离，发现其感染细胞后出现大片融合现象，因此命名为呼吸道合胞病毒(RSV)，属于副黏病毒科RNA病毒。其基因组大小为15kb，编码11个蛋白。其中表面糖蛋白F、G为主要保护性抗原，包括绝大部分中和抗体表位及T细胞抗原决定簇。保守性F蛋白主要诱导CTL，促进CD4+与CD8+T细胞应答，活化Th1免疫应答。特异性G蛋白可诱导Th2偏向性免疫应答，依据G蛋白将RSV分为A和B群两个血清亚型。临床上，RSV呈现交替的优势流行。
　　早在上世纪70年代，采用甲醛灭活研制的FI-RSV疫苗不能产生足够的保护。且80％受试患婴出现免疫增强性疾病(VED)入院治疗，甚至导致2名患儿婴死亡而终止临床研究。随后采用传代培养、临床分离、基因改造方法研制的RSV减毒活疫苗，具备良好的免疫原性及保护性，其潜在的病毒安全性备受争议而止步于二期临床研究。接着采用基因重组制备的F、G蛋白亚单位疫苗，如BBG2Na进入三期临床试验，因保护不全面停止后续研究。另外，采用HPIV、ADV为载体研制的重组载体疫苗进入临床试验研究，因载体病毒具有预存免疫应答（pre-exsiting immunology,PEI）终止试验。由此可见，RSV疫苗研究困难重重，亟需解决如下问题:1）RSV抗原表位完整性;2）机体Th1与Th2免疫应答失衡导致VED;3）减毒潜在的危险;4）PEI导致的CTL应答削弱。
　　近年来，病毒样颗粒(VLP)组装技术日益成熟，其优势逐渐凸显。它是类似病毒自然形态的蛋白颗粒，模拟自然感染过程。因其缺乏核酸物质无复制、重组、传播能力，提高了安全性。现已有研究借助流感M蛋白实现VLP组装，临床前动物试验具有良好的效果。但流感载体存在PEI，加大VED的风险。可见，选择无PEI的病毒基质蛋白应用于RSV VLP组装是发展疫苗的前提。我们所知，新城疫病毒(NDV)是不易感染人的禽源病毒，且基质蛋白M、NP的VLP形成率较高。另外，NDV与RSV同属副黏病毒属，具有一定的同源性，易于组装。由此可见，NDV的骨架蛋白是RSV形成VLP最佳载体。
　　RSV是经过粘膜，感染入侵人体。那么，粘膜免疫产生的sIgA可直接中和病毒，快速阻止其扩散和传播。同时，它也可活化系统性免疫应答，产生IgG中和抗体和CTL细胞应答，有效地保护机体。另外，其免疫方式（滴鼻或无针注射）具有无痛优势，适用于婴幼儿。由此可见，粘膜免疫在RSV的防护中发挥不可替代作用。
　　现今，用于临床治疗RSV感染的药物仅有Palivizumb和Ribavirin，可有效治疗RSV引起的肺炎支气管炎。但Palivizumb需反复注射才能达到治疗效果，且费用昂贵。而Ribavirin具有副作用，不适用于免疫缺陷人群。因此，研制开发新型RSV治疗药物并完善其治疗策略对防控RSV感染意义重大。
　　RSV致病机制对于其预防疫苗及治疗药物设计至关重要。迄今为止，RSV感染致病研究主要集中在RSV免疫逃逸机制、宿主免疫损伤及炎症效应。感染初期，RSV(NS1、NS2、G)可阻碍TLR信号通路，抑制IFN-Ⅰ型应答，避免天然免疫的抗病毒攻击，完成自我复制，传播至下呼吸道诱发肺部疾病。同时，大量RSV聚集活化TLRs、RIG-Ⅰ，诱导促炎基因表达，产生大量的IL-2、IL-6、TNF-α、CCL2、CCL3、IP-10等招募激活免疫细胞，侵入肺组织，造成肺部炎症反应导致损伤。现有研究表明RSV感染导致的细胞死亡与其致病机制密切相关。RSV致病过程复杂，影响因素众多，亟需深入探究。而寻找到宿主的易感基因及致死基因可为阐明RSV致病机制提供大量的试验素材。
　　本研究立足于研发新型VLP疫苗、寻找药物靶标及提出创新理论体系，开展如下两部分研究:
　　重组RSV VLP疫苗的制备及免疫效果的初步研究
　　实验目的:制备及评价重组RSV-VLP蛋白疫苗，为获得RSV候选疫苗提供有力试验证据。
　　实验方法:选择NDV为骨架，嵌合RSV的F和G蛋白，利用昆虫表达系统制备重组RSV-VLP蛋白疫苗并进行初步评价。首先将目的序列进行密码子优化，其次按照M-NP-F或M-NP-G顺序相连，且两两之间加入SV40与polyhedron启动子，插入载体pFastBacⅠ。当双酶切、PCR鉴定构建成功后，将其杆粒转入sf9获得稳定表达杆状病毒，采用WB、电镜证明VLP成功组装。接下来，经密度梯度离心纯化后，滴鼻免疫小鼠，采用ELISA、ELISPOT对其免疫原性进行评价。攻毒后，观察小鼠体重、肺部病理及病毒载量指标，对VLPs免疫保护性进行评价。
　　实验结果:Westernblot检测出RSV表面蛋白60KD的G蛋白和56KD的F蛋白，同时也发现骨架蛋白51KD的NP和40KD的M均有表达，电子显微镜观察VLPs颗粒大小均一，NDV-VLP-G直径集中在91-110nm; NDV-VLP-G直径分布较大，约为51-130nm。上述结果证明VLPs组装成功。小鼠评价试验证实:混合剂型rNDV/RSV/F+G免疫小鼠产生的系统性体液免疫、粘膜免疫及细胞免疫效果均优于单一（rNDV/RSV/F或rNDV/RSV/G）免疫剂型。小鼠保护性试验证实:rNDV/RSV/F+G可以缓解小鼠体重下降，降低肺鼻的病毒载量，更重要的是能够减少肺泡细胞炎症因子的侵入，改善肺组织的纤维化，消除肺部的病灶，有效地保护小鼠。
　　实验结论:成功制各重组NDV-RSV VLPs，证实其能够激活系统及粘膜免疫应答，无VED。其中联合免疫剂型rNDV/RSV/F+G的免疫保护效果均优于单一免疫剂型，可能成为RSV潜力候选疫苗株，为其探究提供了试验数据。
　　RSV感染肺损伤机制研究
　　实验目的:建立siRNA筛选平台，寻找RSV易感及致死基因，探究其功能，为RSV感染致病机制提出新理论体系，同时也为RSV防治提供候选药物靶标。
　　实验方法:筛选siRNA文库，获得有效基因，随后进行功能研究。首先，利用siRNA文库，通过MTS方法检测病毒感染后细胞活力变化，筛选RSV感染致死相关基因，获得有效基因ACE2及MSK-2并继续研究。接着通过收集临床样品，利用Westernblot、ELISA检测AngⅡ、ACE2和ACE变化，通过体重变化、肺湿干比、病理变化完善小鼠肺损伤模型，深入探究ACE2功能。同时，通过Westernblot检测LC3Ⅱ含量转化率，激光共聚焦技术观测自噬小体变化建立RSV诱导自噬模型，结合siRNA敲除、抑制剂试验，开展MSK-2的功能验证工作。
　　实验结果:成功建立筛选平台，已筛选文库基因达4000个，成功获得3个保护基因和10个致死基因。其中ACE2及MSK-2效果显著且稳定，进行深入研究。经过临床标本检测及小鼠实验证明:ACE2在RSV感染导致肺损伤发挥重要作用。RSV感染过后ACE2降低影响血管紧张素2受体1(AT1R)变化进而加重肺损伤。同时ACE2重组蛋白能够有效地缓解RSV导致的肺损伤，为RSV防治提供了有效地药物靶标。通过RSV感染自噬模型的研究发现，MSK-2可能通过调节LC3Ⅱ转化率参与调控RSV感染诱导的自噬，其调控机制还需进一步探究。
　　实验结论:人类全基因组siRNA文库筛选可成功寻找到RSV感染及致死有效基因，为RSV机制研究提供丰富的试验素材及有效地作用靶点。本章节中筛选出保护基因ACE2能够缓解RSV导致的肺损伤，为其治疗提供创新药物靶标。而致死基因MSK-2可调节LC3转化率进而影响RSV诱导自噬，其功能亟需进一步研究，也为RSV致病机制的自噬研究方向提供新思路。

目录

声明

缩略词表

摘要

前言

第一章 重组RSV VLP疫苗的制备及免疫效果初步研究

第一节 重组RSV VLP疫苗的制备

1．材料与方法

2．结果

3．讨论

4．结论

第二节 重组RSV VLP蛋白疫苗免疫小鼠效果评价

1．材料与方法

2．结果

3．讨论

4．结论

第二章 RSV感染肺损伤机制的初步研究

第一节 RSV感染细胞死亡基因筛选及鉴定

1．材料与方法

2．结果

3．讨论

4．结论

第二节 ACE2在RSV导致肺损伤的研究

1．材料与方法

2．结果

3．讨论

4．结论

第三节 MSK-2在RSV诱导自噬的机制探究

1．材料与方法

2．结果

3．讨论

4．结论

全文总结

参考文献

呼吸道合胞病毒中国展望

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