极地微生物抑制植物病原真菌活性菌株的筛选及代谢产物研究

摘要

极地具有独特的地理、气候及环境特征，造就了极地微生物的新颖性和多样性，使其在科学研究、应用开发等方面具有重要的价值，利用极地微生物筛选抑制植物病原真菌的活性菌株和活性代谢物，可成为植物病害防治潜在的新途径。本研究将为极地微生物及其活性产物在生态农业中的推广和应用奠定基础。
　　 本论文以实验室保存的极地微生物为对象，筛选具有抑制植物病原真菌活性的菌株，并对其进行了系统发育分析；对筛选获得菌株Pseudomonas sp.P4-11发酵条件优化、毒理学试验、大棚内防效试验以及产抑菌活性物质的性质、分离纯化与结构鉴定、抑菌机理等进行了研究。
　　 以尖刀镰孢菌(Fusarium oxysporum)为指示菌，采用平板扩散法对实验室保存的730株南极细菌进行了抗菌活性菌株的筛选，共获得了12株具有抑菌活性强且活性稳定的菌株。16S rRNA种属鉴定及系统发育分析的结果表明,7株活性菌株属于假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas)、2株属于嗜冷杆菌属(Psychrobacter)、2株属于假单胞菌属(Pseudomonas)、1株属于伦黑墨氏菌属(Rheinheimera)。抑菌谱的测定结果表明，不同活性菌株的抑菌谱有所不同，12株活性菌株对尖刀镰孢菌、辣椒疫霉(Phytophthora copsici)、大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)和瓜亡革菌(Thanatephorus cucumeris)均有一定的抑制作用，而对葡枝根霉(Rhizopus stolonifer)均没有抑制作用；除菌株Pseudoalteromonas sp.1-Z11、Pseudoalteromonas sp.1-Z18、Pseudoalteromonas sp.4-Z11、Psychrobacter sp.4-Z18、Pseudoalteromonas sp.IS-010-07-1、Pseudoalteromonas sp.P3-11-10-1和Pseudoalteromonas sp.Z18-3外，其余5株菌对水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)均有抑制作用。菌株Pseudomonas sp.P4-11的抑菌效果均要优于其他菌株，作为下一步研究菌株。
　　 响应面法优化菌株Pseudomonas sp.P4-11抑菌活性的发酵条件的结果表明，菌株最适发酵条件为：麸皮 0.9134％，酵母粉 0.6485％，盐度 1.25‰，培养温度 13 ℃，初始pH值 8.75，装液量为80 mL/250 mL，接种量为1％。在优化后的培养基和发酵条件下培养120 h，测得的抑菌圈直径为31.50 mm，比优化前(27.25 mm)提高了15.60 ％。
　　 菌株Pseudomonas sp.P4-11的发酵液毒理学试验的结果表明，大鼠急性经皮、急性经口毒性等级为低毒，对孔雀鱼未见异常。大棚内盆栽防效试验表明，Pseudomonas sp.P4-11发酵液的1:1稀释液对黄瓜白粉病的防治效果为68.26％，1:2稀释液的防治效果为66.57％，均高于1％武夷菌素水剂500倍稀释液63.71％的防效。
　　 菌株Pseudomonas sp.P4-11活性物质的稳定特性的研究结果表明，发酵液抑菌活性对保存时间(0-8周)、温度(30 ℃-60 ℃)、pH(6.0-11.0)值都具有良好的稳定性，产生的抑菌活性物质为一类中等极性的物质。通过抑菌活性追踪检测，采用乙酸乙酯萃取、硅胶柱层析法、高效液相色谱法，对菌株Pseudomonas sp.P4-11发酵液中的抑菌活性物质进行分离纯化，获得3个纯度较高且具明显抑菌效果的化合物(T2-20-7-11-5、T2-20-7-11-6、T2-20-7-11-7)。利用质谱(MS)、核磁共振氢谱(1H NMR)/碳谱(13C NMR)等技术对其进行了结构鉴定。结果表明，化合物T2-20-7-11-5和T2-20-7-11-7均为壬基酚聚氧乙烯醚类化合物。
　　 扫描电镜观察化合物T2-20-7-11-5对尖刀镰孢菌孢子超微结构变化影响的结果发现，该化合物可使尖刀镰孢菌孢子的形态结构发生异常变化，孢子外层小泡消失，有些孢子表面局部凹陷，孢子间粘连在一起，细胞壁严重畸形膨大、破裂，内容物外溢等，甚至有些菌丝体表面也发生严重畸形膨大。

目录

文摘

英文文摘

声明

第1章 绪论

第2章 极地微生物抑制植物病原真菌活性菌株的筛选与种属鉴定

第3章 南极抑菌活性菌株Pseudomonas sp. P4-11发酵条件的优化

第4章 南极Pseudomonas sp. P4-11发酵液的毒理学与防效试验

第5章 南极Pseudomonas sp. P4-11抑菌活性物质的分离纯化与结构鉴定

第6章 总结

参考文献

附 录

致 谢

在学期间主要科研成果