重组炭疽疫苗免疫效应的抗体组库分析

摘要

疫苗对传染性疾病的防控具有重要的意义，其发挥作用主要是通过接种抗原制剂激活获得性免疫和形成免疫记忆，从而对特定病原体实现较长时间甚至终身的免疫。获得性免疫包括细胞免疫和体液免疫两方面，其中抗体与抗原的相互作用是体液免疫发挥功能的基础。抗体（及其膜形式的B细胞受体）是体液免疫保护机体免受特定病原体损伤的关键分子，具有非常丰富的多样性。抗体多样性的来源包括组合多样性、连接多样性和体细胞高频突变三个方面。其中组合多样性是指抗体可变区胚系基因之间的随机组合以及轻重链之间的组合具有丰富的可能性；连接多样性是指抗体可变区三段（重链）或两段（轻链）胚系基因之间不准确的连接造成的多样性；体细胞高频突变是指已经完成重排的抗体基因在抗原刺激后发生的高频的点突变，其也会大大提高抗体的多样性。如此丰富的多样性使得抗体具备几乎可以识别任何机体可能遇到的病原体的潜能。因此，对抗体及其分泌细胞或相应记忆B细胞的分析是疫苗免疫效果评价的重要内容之一。
　　目前考察体液免疫的响应情况主要是采用酶联免疫吸附测定法（ELISA）、酶联免疫斑点法（ELISPOT）等，这些方法虽然可以定性或定量地分析抗原特异性抗体、抗体分泌细胞以及记忆 B细胞的水平，但是不能从分子水平上了解所分析样品中含有的特异性抗体序列为何，又有何特征等。因此，如何获取抗体的序列信息，如何将特异性抗体从总的抗体组中筛选出来，成为亟待解决的问题。但是抗体丰富的多样性给这类分析工作带来了巨大的挑战。
　　随着高通量测序技术的进步，其在越来越多的研究领域得到了应用。由于高通量测序技术能够并行地获取大量的序列信息，并借助相应的生物信息学分析手段对这些序列信息进行处理，因此非常适合研究抗体这类多样性极其丰富的分子。利用高通量测序技术对抗体组进行分析，即为抗体组库技术。
　　目前，抗体组库技术在感染性和自身免疫性疾病研究、免疫耐受机制探讨、疫苗免疫效应的观察、抗体的筛选制备等方面都得到了应用。本研究试图利用抗体组库技术分析基因工程重组炭疽疫苗免疫后的机体响应情况，探索利用抗体组库技术评价炭疽疫苗免疫效应的可行性，同时希望利用免疫效应分析的结果指导特异性抗体的筛选和疫苗的优化设计。
　　建库是抗体组库分析的基础，因此本研究首先建立了利用基因特异性引物进行建库的方法。相比于其他建库方法，基因特异性引物建库的一般优点在于操作简单，建库产物相对较短，利于后续的高通量测序，但存在可能会出现建库偏性的缺点。本研究通过选择合适的引物，避免了建库偏性的问题，利用基因特异性引物建库的结果与无偏性的建库结果相比，三种链型之间的相关系数均在0.65以上。这方便了后续工作的开展。
　　两名志愿者接种了基因工程重组炭疽疫苗，并在28天后进行了一次加免。同时在免疫前，首次免疫后第7天，第28天和第35天采集了志愿者的外周血单个核细胞。在利用 ELISA和毒素中和活性分析（TNA）确认疫苗接种的有效性后，进行建库和高通量测序。
　　测序完成后，首先从抗体多样性来源的角度对抗体组库数据进行分析。分析结果显示：两位志愿者之间及在不同时间点间的胚系基因使用频率非常接近，使用频率最高的基因家族为重链V基因的1、3、4家族（＞83％），重链D基因的3家族（＞28%），重链J基因的4家族（＞45%），kappa链V基因的1、3家族（＞75%）， kappa链J基因的1、2、4家族（＞73%），lambda链V基因的1、2、3家族（＞70%）， lambda链J基因的3家族（＞44%），这与文献报道也是一致的；两位志愿者重链CDR3的平均长度为43个碱基，kappa链CDR3的平均长度为37个碱基，lambda链CDR3的平均长度为31个碱基，且在不同时间点之间以及两位志愿者之间均无统计学差异；两位志愿者重链D基因三种读码框的比例以及三种链型中P-核苷酸和 N-核苷酸的数目分布在疫苗免疫前后同样没有显著的变化；不同时间点之间三种抗体链的碱基突变率有所波动，但这种波动同免疫程序并无明显关联，这可能是由于志愿者在生活中接触的环境抗原的复杂作用湮没了疫苗特异性免疫效应的信号。这说明，胚系基因使用频率的分布情况，抗体互补决定区（CDR）3的组成情况，以及氨基酸使用频率的分布情况能够保持相对稳定的状态，可以视作抗体组库的固有特征；体细胞高频突变情况虽然可以用来考察抗原的选择压力，但由于环境抗原作用过于复杂，因此体细胞高频突变的情况不能直接反映疫苗的免疫效应。
　　考虑到抗体的CDR3在抗原抗体相互作用中的重要性，我们又从 CDR3克隆的角度进行了分析。结果显示：高频CDR3的CDR1 score和CDR2 score显著地低于低频CDR3的CDR1 score和CDR2 score，体现了抗原选择压力对抗体组的塑造效果；高频CDR3的CDR1 score和CDR2 score并不稳定，但是其波动规律未显示出与疫苗免疫流程的关联；重链CDR3克隆的动态变化与疫苗免疫流程关系密切，在初次免疫后的第7天和加强免疫后的第7天（即第35天）新出现克隆所占的比例均超过了60%；kappa链和lambda链在这两个时间点也存在激发出的新克隆，但响应程度较低，第0天已经存在的克隆占据着大约50%的比例；另外，考虑到已有研究指出B细胞克隆的变化与14天后抗体滴度的变化存在正相关关系，重链CDR3克隆的收敛性与志愿者抗原特异性抗体的浓度存在着一致的变化趋势。这表明，CDR3与CDR1或CDR2的配对关系可以用来考察抗原的选择压力，但由于环境抗原作用的复杂性，这种配对关系不能直接反映疫苗的免疫效应；CDR3的动态变化与CDR3的收敛性能够与抗原特异性抗体建立联系，因此能够用过来描述疫苗的免疫效应。
　　这些结果实现了对抗体组库变化特征的分类，同时也证明了利用抗体组库技术分析疫苗免疫效应的可行性，为疫苗免疫效应的描述补充了新的维度。
　　在对 CDR3的动态变化进行分析的基础上，综合考虑 CDR3在单一时间点的静态频率及CDR3动态变化的信息，本研究建立了抗原特异性抗体克隆的筛选策略。利用 ELISA对筛选克隆的抗原结合能力进行鉴定，结果显示，该策略对阳性克隆预测的准确率达到了52%。
　　利用Discovery Studio4.5软件和RCF（residue contact frequency）分析的算法对28株进行抗原表位的预测，并利用ELISA从实验角度验证了抗体结合的抗原表位所在的结构域，结果显示，24株有结合活性的抗体中，21株抗体的表位预测结果与用 ELISA测定的结果都是一致的。这说明本研究所用的表位预测方法是比较可靠的。结合TNA的结果，我们发现，这24株有结合活性的抗体中仅有3株显示出了毒素中和活性。这说明本研究所筛选的高频抗体多为非中和性抗体，即其识别的抗原表位多为非中和表位。这些结果为我们进一步对重组炭疽疫苗进行优化改进提供了思路：削弱强势的非中和表位的影响，加强中和表位的作用将有助于提高疫苗激发中和性抗体的效率，从而提高疫苗的保护效果。
　　综上所述，本研究建立了抗体组库分析的建库方法，利用抗体组库技术分析了基因工程重组炭疽疫苗免疫后机体的响应情况，提出了评价疫苗免疫效应的新指标。在此基础上，我们建立了阳性克隆的筛选策略，分析了抗原特异性抗体结合的抗原表位及其毒素中和活性，为疫苗的进一步优化提供了指导意见。这些工作表明，抗体组库技术可以丰富疫苗免疫效应评价的维度，有助于抗原特异性抗体的筛选，能够指导疫苗的优化设计。

目录

声明

主要缩略词表

前言

第一部分 利用基因特异性引物建库的方法建立与验证

1. 材料与方法

2. 结果

3. 讨论

第二部分 重组炭疽疫苗接种对抗体组库影响的分析

1. 材料与方法

2. 结果

3. 讨论

第三部分 抗原特异性克隆筛选策略的建立及其应用探讨

1. 材料与方法

2. 结果

3. 讨论

结论

参考文献

附录1 两种建库方法得到的胚系基因使用频率汇总

附录2 主要溶液配制

代表性论著

个人简历

致谢