乙脑减毒活疫苗关键功能位点分析及相关病毒载体应用研究

摘要

乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV），简称乙脑病毒，是乙型脑炎（简称乙脑）的病原体，主要流行在东南亚和太平洋地区，在全球范围内每年引起约68，000例乙脑病例，死亡约10，000例。乙脑病毒主要以三带喙库蚊为媒介在脊椎动物宿主之间传播。病毒感染严重危害中枢神经系统，约有50％的幸存者患有伴随终生的神经系统后遗症。近年来，乙脑病毒引起的感染范围正在扩大。乙脑已成为世界上最严重的病毒性脑炎类疾病之一，严重威胁人类健康。
　　疫苗接种是预防乙脑的有效手段。乙脑减毒活疫苗SA14-14-2于1989年在中国被批准上市，已有超过3亿儿童接种了该减毒活疫苗。研究显示，该疫苗株具有良好的减毒特性与安全性，生产成本低，单次免疫即能有效诱导产生保护性中和抗体，而且免疫力持久。2013年，该疫苗株通过了世界卫生组织疫苗生产预认证，被推荐在世界范围内使用。但目前对乙脑活疫苗的减毒机制尚不完全清楚。
　　乙脑病毒属于黄病毒科黄病毒属，是有包膜的单股正链RNA病毒。其基因组编码3种结构蛋白[衣壳蛋白(C)、膜蛋白前体/膜蛋白（prM/M）和包膜糖蛋白(E)]和7种非结构蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5)。结构蛋白主要参与病毒吸附、侵入和组装，非结构蛋白主要负责病毒基因组的复制。研究表明，黄病毒的非结构蛋白NS1能够以细胞表面、细胞内以及细胞外分泌等多种形式表达，与病毒的复制、组装以及宿主的免疫应答调节密切相关。相关研究还发现，乙脑血清亚组各成员在感染过程中还表达一种NS1相关蛋白NS1'，生物信息学分析显示该蛋白是位于NS2A基因上程序性-1核糖体移码的产物。目前，该血清亚组特有的NS1'蛋白在乙脑病毒致病过程中的表达及功能尚未明确。
　　另一方面，近年来乙脑病毒的流行范围和分布区域发生了较大的改变。基因Ⅰ型病毒已经逐渐取代原有的基因Ⅲ型病毒成为当下主要的流行株，而现有的所有乙脑疫苗都来源于基因Ⅲ型病毒。有研究显示，来源于Ⅲ型的灭活疫苗诱导宿主产生针对其他基因型病毒株的中和抗体能力明显降低。乙脑减毒活疫苗对目前的Ⅰ型病毒流行株的保护作用是否受到影响尚有待研究，发现并确认影响乙脑疫苗株保护效力关键的中和位点对乙脑的防控和治疗具有重要的意义。
　　此外，乙脑疫苗株高度减毒，具有良好的安全性及免疫原性，因此有望发展为新的病毒类表达载体。
　　针对上述科学问题，本研究首先对决定NS1'蛋白表达的关键因素以及NS1'蛋白在乙脑病毒致病过程中发挥的作用进行了探讨，进一步发现并确认了影响乙脑疫苗株诱导中和抗体效价的基因型特异中和位点，最后对该疫苗株表达外源基因的可行性和特性进行了评估。
　　本研究主要包括三个部分:
　　一、乙脑病毒非结构蛋白中的毒力位点鉴定与分析
　　为寻找决定NS1'蛋白表达的关键因素及其对病毒毒力的影响，本研究将野生型乙脑病毒SA14与减毒疫苗株SA14-14-2感染BHK-21与C6/36细胞，通过Western blot检测感染细胞中NS1与NS1'蛋白的表达。结果表明，SA14能够在感染细胞中同时表达2种形式的NS1蛋白，而在SA14-14-2感染细胞中仅能检测到NS1蛋白的表达。
　　通过核苷酸序列比对发现，与JEV血清亚组的病毒分离株相比，在疫苗株SA14-14-2 NS2A基因第66位核苷酸存在一个沉默突变(G→A)，称为G66A。对乙脑病毒基因组相应区域进行RNA结构预测发现，G66A核苷酸突变影响了位于NS2A基因上的假结结构稳定性，而该假结结构是NS1'蛋白形成的必要条件。
　　为证实该沉默突变对NS1'蛋白表达及病毒毒力的影响，我们在乙脑病毒SA14全长感染性克隆的基础上引入G66A核苷酸突变，拯救获得携带该突变的恢复病毒(G66A)。评价SA14与突变病毒G66A感染细胞中NS1相关蛋白的表达发现，与SA14相比，G66A丧失了NS1'蛋白的表达能力而只能表达NS1。随后，通过比较SA14与G66A突变病毒在小鼠模型上的致病性发现，突变病毒G66A的神经毒力与神经侵袭力均明显弱于SA14，且在鼠脑中的增殖能力也低于SA14。
　　上述研究结果表明，乙脑病毒NS2A的第66位核苷酸突变G66A影响了假结结构依赖的移码，进而抑制了NS1'蛋白的表达，是乙脑病毒的一个新的关键毒力位点。
　　二、乙脑病毒基因型特异中和位点的鉴定与分析
　　为了分析乙脑疫苗株对不同基因型病毒株的保护效力，本研究首先评价了16份减毒活疫苗免疫人血清样品对疫苗株SA14-14-2以及乙脑病毒分离株FJ03、 SX06、SC04和SH53的中和效价。结果表明，免疫血清对乙脑病毒分离株的中和效价要显著低于疫苗株。
　　为进一步分析影响中和抗体效价的关键因素，本研究对基因Ⅰ型和基因Ⅲ型乙脑病毒的E蛋白氨基酸序列进行了比对，发现第222和327位氨基酸是基因型特异的氨基酸位点。进一步利用反向遗传学技术将A222S与S327T氨基酸突变引入到基因Ⅲ型乙脑病毒感染性克隆中，拯救携带相应氨基酸突变的恢复病毒（A222S、S327T和A222S/S327T）。突变病毒的蛋白表达效率、蚀斑形态、体外增殖特性和病毒毒力与野生型病毒相比无明显差异，而蚀斑减少中和试验结果表明，乙脑疫苗SA14-14-2免疫血清对突变病毒的中和效价与野生型病毒相比有所降低，该结果表明A222S与S327T突变可能影响了减毒活疫苗免疫诱导的中和抗体效力。
　　本研究进一步将相应的氨基酸突变引入到乙脑减毒活疫苗中，并评价了突变疫苗株对基因Ⅰ型病毒分离株SX06和SH53的保护效力。结果显示，携带A222S与S327T氨基酸单点突变的疫苗株免疫小鼠诱导的中和抗体效价与原疫苗株相比较高，且突变疫苗株保持了较好的遗传稳定性与减毒特性，表明E蛋白中基因型特异氨基酸位点可能是乙脑病毒潜在的重要中和位点，将A222S与S327T氨基酸突变引入减毒活疫苗基因组中有助于提高其对基因Ⅰ型病毒流行株的保护效力。
　　三、基于乙脑减毒株的病毒表达系统的建立与应用
　　本研究以乙脑减毒株感染性克隆为基础，通过反向遗传学技术，将基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)的结构基因E3-E2 DomainA片段与脑心肌炎病毒的内部核糖体进入位点序列引入乙脑病毒基因组C基因下游，并在CHIKV基因编码区末端添加终止密码子，构建了携带CHIKV抗原基因的重组病毒感染性克隆。体外转录制备的相应RNA转染细胞后能够导致典型的细胞病变效应，RT-PCR结果显示外源基因被成功插入到乙脑病毒基因组中。重组病毒在BHK-21细胞上形成的蚀斑明显小于乙脑减毒株，且在细胞上的增殖能力有所降低。间接免疫荧光实验证实重组病毒能够有效表达CHIKV外源蛋白。上述结果表明，本研究成功构建了携带CHIKV抗原基因的重组乙脑病毒，并证实了乙脑减毒株作为病毒载体的可行性，该表达系统为新型重组病毒类疫苗的设计和研发奠定了基础。
　　综上，本研究以乙脑病毒感染性克隆为基础，将生物信息学技术与反向遗传学突变分析相结合，证实了乙脑减毒活疫苗SA14-14-2非结构蛋白NS2A中的G66A核苷酸突变破坏了假结结构依赖的核糖体移码，从而抑制了NS1'蛋白的表达，最终降低了病毒的神经毒力以及神经侵袭力;本研究还系统分析了病毒E蛋白中基因型特异氨基酸位点对中和抗体效价的影响。最后，本研究建立了以乙脑减毒株为病毒载体的表达系统，成功实现了外源抗原的重组表达。上述研究结果不仅加深了我们对乙脑病毒致病机制的理解，而且为乙脑疫苗株免疫效力的优化提供了新的思路，同时也为基于乙脑疫苗株的新型病毒重组表达系统的建立和优化奠定了坚实基础。

目录

声明

缩略词表

摘要

前言

1．乙脑病毒重要毒力位点的鉴定与乙脑活疫苗的减毒机制研究

2．乙脑减毒活疫苗对病毒流行株的保护效力及其影响因素

3．乙脑减毒株相关的病毒载体应用研究

第一部分 乙脑病毒非结构蛋白中的毒力位点鉴定与分析

1 引言

2 材料与方法

3 结果

4 讨论

第二部分 乙脑病毒基因型特异中和位点的鉴定与分析

1 引言

2 材料与方法

3 结果

4 讨论

第三部分 基于乙脑减毒株的病毒表达系统的建立与应用

1 引言

2 材料与方法

3 结果

4 讨论

总结

参考文献

文献综述 黄病毒NS1’蛋白的研究进展

代表性论著

个人简历

致谢