恶臭假单胞菌海藻糖合酶基因在大肠杆菌中的表达

摘要

海藻糖具有非常重要生物学意义的,对生物大分子起到一定的保护作用,可以保护生物免受干燥、高温、低温、辐射、高渗等恶劣环境的伤害,因此具有巨大的市场前景和应用价值。海藻糖的研究兴起于日本,后在各国掀起了研究热潮。近年来国内对海藻糖的研究,主要集中在酵母的抽提和微生物发酵领域,但在分子生物学领域才刚刚起步。随着越来越多的海藻糖合酶基因公布于众,海藻糖在分子生物学领域的研究越来越热。
　　本课题正是使用基因工程手段,通过对恶臭假单胞菌海藻糖合酶目标基因的克隆和外源载体的高效表达获得大量目的蛋白,摆脱了代谢调控机制对海藻糖合酶基因的控制,得到稳定的重组菌,使酶量得到显著提高,酶活相对增加,为利用该酶转化麦芽糖生成海藻糖的工业化生产奠定研究基础。
　　本研究以恶臭假单胞菌P06基因组DNA为模板,通过PCR技术、双酶切、连接载体、导入大肠杆菌BL21(ED3),成功克隆了P06菌株的海藻糖合酶基因。通过测序对P06海藻糖合酶基因进行了分析,并构建了P06海藻糖合酶的系统进化树,说明恶臭假单胞菌的海藻糖合酶基因具有一定的同源性和保守性。对重组菌进行IPTG诱导,成功表达目的蛋白。对基因工程菌进行酶活测定,表明每毫升粗酶液酶活达到11.84U/mL,每克干菌体的酶活达到297.6U/g,比原始菌株P06有较大提高。对重组菌的遗传稳定性进行了测试,六次传代后质粒丢失率为20％,说明构建的基因工程菌可稳定传代。
　　对实验室摇瓶发酵时的诱导条件进行了优化,然后在此基础上对影响酶活的关键参数进行优化。最终确定:诱导温度为25℃,诱导剂添加量为0.6mmol/L,诱导时机为培养至OD600=0.8时开始诱导,诱导时间为6h;粗酶液反应体系中最适pH为7.5,反应温度35℃、体系反应2h、底物浓度为30％。在优化后的最有条件下,对样品海藻糖含量进行高效液相色谱检测。每毫升粗酶液酶活力为318.12U/mL。
　　通过对5L发酵罐高密度培养条件的探索,采用流加葡萄糖和氮源的方式可以大大延长对数期并且增加菌体收得率,发酵总时长21h,保持溶氧30％以上,菌体干重达到最大值25.64g/L。进一步对其进行诱导,选择为12h,经过6h的诱导,菌体干重达到20.4g/L,测得粗酶液的酶活为159U/mL。

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第1章绪论

1.1海藻糖及其理化性质

1.2海藻糖的生物学保护机理

1.3海藻糖的生物学功能

1.4海藻糖的检测

1.5海藻糖的生产方法

1.6海藻糖的应用

1.7本课题的立题背景和研究内容

第2章Pseudomonas putida P06培养特性及分类鉴定

2.1引言

2.2材料和方法

2.3实验方法

2.4结果与讨论

2.5本章小结

第3章恶臭假单胞菌P06海藻糖合成酶基因的克隆与表达

3.1引言

3.2实验材料

3.3实验方法

3.4实验结果分析

3.5本章小结

第4章重组E.coli BL21（DE3）的培养及条件优化

4.1引言

4.2 实验材料和仪器设备

4.3实验方法

4.4实验结果与讨论

4.5台式5L发酵罐高密度培养工程菌条件的初步探讨

4.6本章小结

第五章结论与展望

5.1主要结论

5.2课题展望

参考文献

致谢

在学期间主要科研成果