南极冰藻Chlamydomonas sp.ICE-L低温胁迫相关基因的克隆和功能验证

摘要

严酷的极地环境造就了生活在南极海冰中的绿色浮游植物南极冰藻Chlamydomonas sp.ICE-L独特的抗低温生物学特性,该藻是研究绿色光合生物低温适应机制,筛选抗寒相关基因的理想材料。
　　本研究利用批量实时定量PCR技术,小规模地对南极衣藻在冰冻胁迫条件下的转录组学进行分析。从课题组完成的南极衣藻ICE-L的表达标记序列(EST)中,筛选了304条与Genbank中已知序列匹配的基因,通过荧光实时定量PCR技术,研究它们的mRNA在南极衣藻受到低温胁迫时表达量的变化情况。在-20℃处理条件下,相对于7℃对照,共有62个稳定上调表达的基因和29个稳定下调表达的基因。研究发现,在受到冰冻胁迫时,为了维持正常的新陈代谢,许多与糖代谢相关的基因表达量明显上调,例如淀粉合成酶。海冰光合生物在适应冰冻环境与其光合作用的调节是分不开的,的研究也证实,冰冻胁迫时为了增加捕光效率,几种捕光蛋白和光合作用相关的蛋白表达量都明显升高。为了维持在冰冻胁迫条件下各种蛋白分子结构的稳定,多种分子伴侣基因例如HSP70、HSP90等的表达量明显上调。为了保证转录、翻译过程的顺利进行,冷激活的RNA结合蛋白基因、RNA解旋酶基因的表达量都明显增加,这些基因在维持南极冰藻的低温适应过程中都发挥着非常重要的作用。对上调表达基因中的硝酸还原酶基因和冷激活的RNA结合蛋白基因进行了更为深入的功能研究。
　　诱导型硝酸还原酶(NR)具有催化亚硝酸盐的单电子还原合成一氧化氮(NO)的能力;近年来的研究发现,依赖于NR的NO合成对植物的冷适应有很重要的作用。通过对南极衣藻ICE-L的硝酸还原酶基因进行生物信息学分析,结果显示,NR基因的编码区长2589bp,共编码862个氨基酸。在以氨基酸序列构建的系统进化树中,南极衣藻的NR序列和其他绿藻类的聚在一起,与团藻、莱茵衣藻、杜氏盐藻和小球藻的同源性依次分别为63％、61％,60％和54％,另外还对南极衣藻NR的基因编码的蛋白序列进行了三级结构预测。运用实时定量PCR技术,分析南极衣藻ICE-L的硝酸还原酶基因在不同温度(-20℃,-12℃,0℃,7℃,16℃)和时间(0.5h,1.5h,3h,6h,12h)胁迫下的表达量变化。结果表明,随着温度降低,ICE-L的NR基因的表达量上升,而且随着胁迫时间的增加,表达量呈现先上升后下降的趋势,-20℃下的相对表达量是16℃下的4倍,在3h的达到最高,相对变化量为3.1。通过体外测酶活的方法测定了ICE-L的硝酸还原酶活性,结果发现,在低温下,硝酸还原酶的活性保持在一个较高水平。
　　冷激活的RNA结合蛋白是重要的转录调控因子,在很多物种的冷适应过程中发挥重要作用。对南极衣藻ICE-L的冷激活的RNA结合蛋白进行了生物信息学分析,结果显示,ICE-L的GRP基因的编码区长468bp,共编码155个氨基酸。在对11种不同GRP氨基酸序列的同源性分析中发现,ICE-L的GRP基因还有两个RRM结构的保守的基序,RNP-1和RNP-2;同时在构建的GRP氨基酸序列的系统发育树中发现,南极衣藻ICE-L的GRP基因与拟南芥的AtGRP7、甜樱桃和小立碗藓的亲缘关系比较近。另外,还将南极衣藻ICE-L的GRP基因构建到原核表达载体pET-28a(+)中,在大肠杆菌表达系统中成功的诱导表达。
　　对南极冰藻基因转录组的研究,获得了一些非常有价值的信息,筛选到了一些与南极衣藻低温适应性密切相关的基因,有的已经在其它物种中得到了验证,还有更多的则属于首次发现,对这些基因及其参与的代谢途径的进一步分析,将有助于揭示南极衣藻的嗜冷机制,并发现合适的功能基因用于农作物转基因,从而提高其逆境适应能力。

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第1章 绪论

1.1南极衣藻Chlamydomonas sp. ICE-L概述

1.2嗜冷微生物低温生存机制的研究

1.3南极冰藻的分子生物学研究现状

1.4功能基因研究的主要方法

1.5课题的研究目的及意义

第2章南极衣藻Chlamydomonas sp. ICE-L功能基因的筛选

2.1材料与方法

2.2结果与分析

2.3讨论与小结

第3章南极冰藻Chlamydomonas sp.ICE-L硝酸还原酶基因的特征分析

3.1材料与方法

3.2结果与分析

3.3讨论与小结

第4章南极冰藻Chlamydomonas sp. ICE-L GRP基因的克隆和原核表达

4.1方法与材料

4.2结果与分析

4.3讨论与小结

第5章总结与展望

5.1总结

5.2展望

参考文献

致谢

在学期间主要科研成果