阿特拉津量热传感快速检测技术研究

摘要

本项目以食品生产过程中典型农药污染物阿特拉津(ATZ)为靶标，针对现有生物检测方法因对样品光学性质要求高导致的样品前处理复杂与检测信号需要多次放大导致的检测步骤繁琐及仪器法中检测设备昂贵等不足对快速检测技术的发展的制约，通过建立新型量热检测技术平台加以克服。阐明热信号转换与调控机制，优化流动注射控制、热信号采集与再生等系统，实现食品中农药残留的样品前处理简便、特异快速定量分析，为量热传感技术在食品安全领域的应用奠定理论基础、提供技术支持。
　　本研究室成功构建了针对典型三嗪类农药残留ATZ的量热检测方法体系。
　　1、基于固定化单克隆抗体的直接竞争量热检测技术
　　首先对ATZ进行羧基化修饰并采用碳二亚胺法与β-内酰胺酶偶联得到酶标记的ATZ(ATZ-β)。另一方面，将纯化得到的ATZ单克隆抗体(mAb)通过戊二醛法固定于固相载体-可控有孔玻璃球(CPG)上，并将其作为量热调节器（恒温装置）中反应柱填料，作为识别元件。
　　本方法选用β-内酰胺酶及青霉素G钠为酶-底物对子进行量热检测方法的建立。制备的ATZ-β，经MALDI-TOF/MS鉴定，摩尔偶联比为ATZ∶β-内酰胺酶为2∶1。经辛酸-硫酸铵盐析法对ATZ腹水型单克隆抗体进行纯化。经BCA蛋白定量法测定，纯化后蛋白含量为2.8 mg mL-1。检测条件优化结果为:ATZ-β0.25 mg mL-1（稀释比为1∶10）、底物选用青霉素G钠浓度，最佳使用浓度为16 mmol L-1。量热体系流动相流速优化为800μl min-1。再生液组分优化为0.1mol L-1 pH2.3的Gly-HCl并含有1％ DMSO、0.1％ TritonⅩ-100(v/v)，再生时间为10min。建立的直接竞争检测方法，线性检测范围为0.7-3.9μg mL-1，检出限为0.4μg mL-1。信号稳定性良好，相同样品连续上样6次，信号相对标准差在5％以内。该检测方法仅对三嗪类农药中西玛津有明显交叉反应(36.4％)，认为主要是由于两者结构高度类似，后者仅比前者多一个甲基。对于其它结构类似物未检测到交叉反应性。对分别以玉米秸秆及双蒸水为基质的样品量热信号比较发现，量热检测方法受基质效应影响不明显。以新鲜玉米秸秆及玉米秸秆青储为实样进行加标回收实验。样品仅需过滤与调整pH后即可进样。加标回收实验回收率在88％-107％之间，与高效液相色谱法(HPLC)检测结果具有良好的一致性。该量热检测方法信号响应稳定、重现性好，样品前处理简便。从加入待测样品到加入酶特异性底物产生完整量热信号需要时间约12 min。将进样前本底信号的测定、产生量热信号后的再生步骤及流动相转换为载液后基线的恢复所消耗的总时间计算在内，一个样品的检测总时间约为45 min。固定化抗体柱可稳定检测约130-150样品。使用完毕，反应柱于4℃保存于载液内或20％乙醇溶液内。
　　建立的量热检测方法样品前处理简单，信号响应直观快速，实现了对玉米秸秆样品的加标检测，检测灵敏度满足相关最大残留量限量标准。本方法的建立，克服了传统检测方法的不足，实现了针对典型三嗪类除草剂ATZ的特异性、快速量热检测方法的建立。固定化抗体柱稳定性好，可满足现场、快速农药残留检测的要求，可以作为农药残留现场快筛查手段之一，在实际工作中推广应用。
　　2、基于ProteinG琼脂糖凝胶的通用性量热传感技术研究
　　在建立方法一的基础上，通过引入离线孵育步骤与使用通用性识别元件构建高灵敏、通用性量热生物检测技术。含有ATZ的待测样品中加入一定量ATZ-β与mAb。基于竞争法原理，在离线孵育条件下：37℃水浴，样品混合液中ATZ与ATZ-β竞争结合mAb上的特异识别位点，形成抗ATZ-mAb和ATZ-β-mAb复合物。
　　本方法在重新计算投料量及投料比的基础上，重新制备了ATZ-β。将MALDI-TOF/MS鉴定，摩尔偶联比达到ATZ∶β-内酰胺酶为11∶1。离线孵育条件为37℃30 min。样品混合液中另需加入0.5％甘油，以增加蛋白表面水膜稳定性，减少因其所致的非特异性吸附，进而增加信号响应特异性。对酶特异性底物进行了筛选并对其使用浓度进行了优化，最终确定为Amp4 mmol L-1。量热检测体系流速优化为400μl min-1。新制备的ATZ-β浓度为0.8gL-1，优化后最佳使用稀释比为1∶100。ATZ-mAb与方法一中一致，浓度为2.8 mg mL-1，但是其最佳使用稀释比优化为1∶8000。再生液组分优化为0.1mol L-1 pH2.3的Gly-HCl溶液并含有1％ DMSO、0.1％ TritonⅩ-100(v/v)及500 mmol L-1 NaCl。
　　本方法的建立实现了量热检测高灵敏度与强通用性的结合。离线孵育与流动相分离更利于二者反应条件的分别优化。在优化后的37℃、30min水浴并含有0.5％甘油的离线孵育环境中，ATZ与ATZ-β实现对mAb结合位点的充分竞争结合。以对mAb上Fc区域有特异识别能力的PGSFF柱为流动相下识别元件，可以实现在不更换反应柱的条件下对具有相应抗体与酶标待测物的任意待测物进行检测。PGSFF柱可重复使用次数不如固定化抗体柱的使用次数，但也足以满足实际检测中对反应柱连续检测性能的需要。本方法成功实现对自来水加标样品的检测。与方法一相比，在样品前处理简便的前提下极大的提高了ATZ检测灵敏度及可检测目标物范围，为量热传感快速检测技术在食品安全领域的应用提供了进一步的理论与技术支持。
　　3、基于双功能表面分子印迹聚合物的量热仿生传感技术研究
　　针对传统免疫检测中作为识别元件的生物抗体制备周期长、干扰因素多及检测方法中用以促进溶解的有机溶剂易对抗体活性造成损伤的不足，将模拟抗体——微米级表面分子印迹聚合物(S-MIP)作为识别元件及产热元件与量热技术相结合建立量热仿生传感技术。
　　通过对比分析，本方法选定以SSS为功能单体，在氨基化CPG表面通过表面同步接枝印迹聚合技术制备S-MIP。印迹体系溶剂选用DMF∶水=9∶1(v/v)，其中水相为pH3.8的乙酸-乙酸钠缓冲液。
　　与生物识别元件相比，本方法筛选并应用的既可以作为识别元件也可以作为产热元件的S-MIP，具备制备方法简便、制备周期短，不同批次识别元件的一致性容易控制的优势。该方法的建立实现了农药残留的无标记、快速量热检测，通量较前两种方法明显高。本方法中反应柱可重复使用百次以上而无需频繁再生，非常利于大规模样品的现场快速筛查。但其特异性不足需要进一步通过优化印迹配方，制备新型印迹材料加以克服。
　　4、基于直接竞争的农药残留高灵敏量热仿生传感技术研究
　　在已有量热仿生传感技术的基础上，通过优化印迹配方及引入竞争法建立高灵敏量热仿生检测方法。印迹体系溶剂选用DMF∶水=9∶1(v/v)，其中水相为pH5.8的乙酸-乙酸钠缓冲液。印迹材料投料量为:模版分子ATZ2.85 g，功能单体MAA5.635 mL，交联剂BIS1.46 g，引发剂APS0.136g;投料摩尔比为MAA∶ ATZ=5∶1，MAA∶ BIS=7∶1，APS为MAA质量的1.1％。等温吸附实验未观测到明显吸附。载液为0.02 mol L-1 pH5.8的乙酸-乙酸钠缓冲液，含有2％ DMF。体系温度选定为37℃，流速优化为1000μL min-1。再生液为含有1mol L-1NaCl的50％(v/v)甲醇水溶液，再生时间为2min。与对苯乙烯磺酸钠相比，以MAA为功能单体制备的印迹产物S-MIP可以产生明显竞争抑制信号。在实验条件优化的基础上建立了高灵敏量热仿生技术。0.8 mg mL-1 ATZ-β使用稀释比优化为1∶400，酶特异性底物Amp浓度为4 mmol L-1。该方法线性检测范围为0.6-4.1ng mL-1，检出限为0.4 ng mL-1。信号稳定性良好，相同样品连续上样6次，信号相对标准差在2％以内。该方法具有很好特异性，与结构类似物西玛津交叉反应率仅为5.7％，与三聚氰胺交叉反应率为3.7％。以自来水为目标物进行加标回收实验，回收率在89.8％-95.3％之间，检测结果与高效液相色谱-质谱/质谱法(HPLC-MS/MS)具有较好的可比性。S-MIP可稳定连续检测30-50次。从进样到加入底物产生完整量热响应信号需约9 min。将进样前本底信号测量、进样并测定量热信号后的再生及流动相恢复为载液后恢复稳定基线的时间计算在内，一个样品的完整检测时间为约30 min。虽然连续检测样品之间需要再生，但是在检测灵敏度上较前一个建立的量热仿生方法有3个数量级的提高。S-MIP识别特异性优于ATZ的mAb，说明合成的识别元件其识别能力可以优于单克隆抗体，为进一步优化印迹配方提供了理论支撑。在量热信号上，随着ATZ浓度增加，一定范围内信号响应线性良好，实现了高灵敏量热仿生技术的建立。
　　该方法实现了量热传感技术与表面分子印迹技术相结合的高灵敏量热仿生检测法建立。以S-MIP为识别元件，基于竞争法原理在流动相下实现了对农药分子的高灵敏、高特异检测。虽然每个样品检测后均需再生使得检测通量有所下降，但是检测灵敏度的大幅提升使得可检测目标物范围大为拓展。与建立的第二种检测方法——以PDSFF为识别元件的通用性量热检测方法相比，本方法未采用孵育步骤，但是检测灵敏度与方法二接近，且特异性更佳，说明S-MIP良好的识别能力。

目录

声明

缩略词表

摘要

前言

1 阿特拉津概述

2 研究的目的与意义

3 国内外研究现状与发展动态分析

4 学术价值和应用前景

5 解决的关键科学问题

6 思路形成

6．1 研究目标

6．2 研究内容

6．3 研究方案

第一章 基于固定化单克隆抗体的直接竞争量热检测技术

1 材料

1．1 实验试剂

1．2 主要仪器及耗材

1．3 主要溶液的配制

2 方法

2．1 阿特拉津的羧基化修饰与鉴定

2．2 阿特拉津羧基化产物与蛋白偶联产物的制备及鉴定

2．3 阿特拉津腹水型单克隆抗体的纯化

2．4 阿特拉津抗体纯化效果鉴定

2．5 阿特拉津单克隆抗体的固定化

2．6 纯化后抗体及羧基化阿特拉津与OVA偶联产物的蛋白定量

2．7 纯化后抗体效价的测定

2．8 检测方法条件的优化

2．9 检测方法选择性研究

2．10 加标回收及方法学比对实验

3 结果

3．1 核磁氢谱对羧基化阿特拉津的鉴定结果

3．2 MALDI-TOF-MS对ATZ-β鉴定结果

3．3 抗体纯化效果鉴定

3．4 酶-底物对子的选择结果

3．5 青霉素G钠及ATZ-β使用浓度优化

3．6 再生条件的优化

3．7 检测方法标准曲线建立

3．8 检测方法选择性研究

3．9 加标回收实验

4 结论与讨论

第二章 基于Protein G琼脂糖凝胶的通用性竞争量热传感技术研究

1 材料

1．1 实验试剂

1．2 主要仪器及耗材

2 方法

2．1 ATZ-β的制备及鉴定

2．2 通用性识别元件的选择

2．3 检测方法条件的优化

2．4 加标回收实验

3 结果

3．1 ATZ-β鉴定结果

3．2 底物及其使用浓度的选择

3．3 再生条件的优化

3．4 检测方法标准曲线建立

3．5 检测方法选择性研究

3．6 加标回收实验

4 结论与讨论

第三章 基于双功能表面分子印迹聚合物的量热仿生传感技术研究

1 材料

1．1 实验试剂

1．2 主要仪器及耗材

1．3 主要溶液的配制

2 方法

2．1 S-MIP的制备及鉴定

2．2 S-MIP对ATZ的等温结合实验

2．3 检测条件优化及标准曲线建立

2．4 加标回收实验及方法学比对

3 结果

3．1 S-MIP制备及SEM鉴定结果

3．2 S-MIP对ATZ的等温结合实验结果

3．3 检测条件优化及标准曲线建立

3．4 检测方法选择性研究结果

3．5 加标回收实验及方法学比对结果

4 结论与讨论

第四章 基于直接竞争的农药残留高灵敏量热仿生传感技术研究

1 材料

1．1 实验试剂

1．2 主要仪器及耗材

1．3 主要溶液的配制

2 方法

2．1 S-MIP的制备及鉴定

2．2 S-MIP对ATZ的等温结合实验

2．3 检测方法条件的优化及标准曲线建立

2．4 加标回收实验

3 结果

3．1 S-MIP制备及SEM鉴定结果

3．2 检测条件优化结果

3．3 检测方法标准曲线建立

3．4 检测方法选择性研究

3．5 加标回收实验

4 结论与讨论

结论与展望

参考文献

文献综述 量热传感器原理及其应用进展

在读期间发表文章、申报专利和参与课题情况

个人简历

致谢