基于简化氨基酸的肌激酶表达、纯化、结晶与初步功能研究

摘要

蛋白质的起源机制是生命起源研究最有挑战性的问题之一。基于小分子配体的保守性，我们实验室提出蛋白质起源的小分子诱导、选择模型，认为最早产生的蛋白质是ATP等小分子诱导和选择的结果。为了对该模型进行实验验证，采用“自上而下（Top-Down）”的策略，设计完全由存在于原始环境中的简化氨基酸组成的蛋白序列，并对理论设计的蛋白序列进行表达、纯化、结晶。我们选取大肠杆菌肌激酶的序列为模板，前期已完成氨基酸的简化，并得到了新的序列，本文针对这一理论设计的蛋白进行了表达、纯化、结晶和初步的功能研究，主要结果如下：
　　（1）利用分子克隆技术，构建融合表达载体。将设计的氨基酸序列转化为核苷酸序列，添加Nde I/Xho I为酶切位点，优化密码子后人工合成全长的基因375bp，并将这段基因克隆到载体pET28b上，构建表达载体pET28b-cAK，导入大肠杆菌BL21（DE3）菌株中。
　　（2）目的蛋白表达和纯化。对构建成功的表达载体，从诱导温度、IPTG浓度、诱导时间等方面进行了条件优化，而且进行了高效自诱导表达。结果表明：目的蛋白（命名为 cAK）可以进行可溶性表达，而且表达量很高，自诱导表达的目标蛋白质的量是普通诱导表达的8-10倍。对融合蛋白进行了两步IMAC纯化，Thrombin酶切，获得了高纯度的cAK蛋白。
　　（3）cAK结晶条件的筛选。我们对cAK自由态以及与小分子形成的复合态分别进行了结晶条件的初步筛选，获得了三个结晶条件，为后续结构研究奠定了基础。
　　（4）初步探讨了小分子与cAK之间的相互作用。通过CD测定，我们发现小分子的加入使蛋白质构象发生了明显变化。另外发现ADP的加入增强了cAK自身的稳定性，使其在室温的降解速率显著变慢。

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第一章 引言

1 .1 化学进化学说

1 .2 氨基酸起源研究

1 .3 密码子起源研究

1 .4 氨基酸起源顺序研究

1 .5 原始蛋白起源相关研究

1 .6 研究内容

第二章 简化氨基酸肌激酶蛋白的融合表达纯化

2.1 引言

2.2 实验材料

2.3 实验方法

2.4 结果分析

2.5 小结

第三章 c AK蛋白的结晶

3.1 引言

3.2 实验材料

3.3 实验方法

3.4 结果分析

3 .5 小结

第四章 小分子与c AK蛋白相互作用的初步研究

4.1 引言

4.2 实验材料

4.3 实验方法

4.3 结果分析

4 .4 小结

第五章 总结与展望

5.1 总结

5.2 展望

参考文献

附录

硕士研究生期间发表的文章

致谢