新生儿乙型肝炎病毒宫内感染传播途径的分子机制研究

摘要

目的：了解HBsA阳性孕妇其新生儿发生HBV宫内感染的危险因素，为预防和控制新生儿HBV宫内感染提供参考。探讨乙型肝炎病毒感染外周血单个核细胞的情况，并利用原位PCR技术检测PBMC中HBV的表达情况，研究PBMC在发生HBV宫内感染中的作用。
　　内容与方法：
　　1.新生儿HBV宫内感染危险因素分析
　　（1）研究对象
　　连续收集2008年8月至2012年9月北京地区各级医院产前检查的HBsAg阳性孕妇及其新生儿共312对作为队列，收集研究对象的临床流行病学数据并采集血液标本。
　　（2）研究方法
　　1）流行病学调查：
　　采用巢式病例对照研究的方法，使用统一定制的调查表，对研究对象进行详细询问并记录，同时将临床检查结果一并填写进调查表中。
　　2）血清学检测：
　　采用酶联免疫吸附试验（ELISA）双抗夹心法，对研究对象的血液标本中的HBsAg和HBeAg进行检测；选取HBV S基因启动子和终止子附近的保守序列设计引物，检测血清和PBMC中的HBV DNA。
　　3）统计分析方法：
　　先将资料进行核查，然后录入EpiData3.1，建立数据库，然后用SPSS22.0软件对数据进行处理与分析；计量资料的结果使用-χ±S表示，分析方法使用t-text检验分析；计数资料的结果使用率或构成比表示，比较时使用t-text或者χ2检验；使用Excel2013和GraphPad Prism5.0软件对图表进行处理。
　　2.PBMC转染实验以及细胞原位PCR技术检测PBMC中HBV DNA和cccDNA
　　（1）PBMC转染实验
　　通过PCR扩增得到HBV DNA基因组全长片段，通过连接构建入T载体，转入感受态细胞后，经涂板蓝白斑筛选阳性后扩大培养，使用含去除内毒素的质粒提取试剂盒提取质粒后，利用扩增时加入的酶切位点，酶切产物，得到高浓度HBV DNA全基因组质粒。分离健康人PBMC后，经过电转染方式将HBV DNA转染进入健康人PBMC中，通过培养后检测PBMC中HBV的表达。
　　（2）细胞原位PCR技术检测PBMC中的HBV DNA和cccDNA
　　将获得的HBV感染者的血浆，经过Ficoll密度梯度离心法分离得到PBMC，通过细胞甩片机将PBMC离心固定至粘附载玻片上，利用原位PCR技术检测PBMC中的HBV DNA；使用滚环扩增加跨缺口原位PCR技术检测PBMC中的cccDNA，在显微镜下观察其HBV DNA和cccDNA在细胞中的分布和位置。
　　结果：
　　1.HBV母婴传播的危险因素分析
　　（1）HBsAg阳性孕妇其婴儿血液标本的实验室检测结果分析
　　对312例HBsAg阳性孕妇及其新生儿的实验室检测结果表明，共142例孕妇其新生儿发生了HBV宫内感染，宫内感染率为45.5％（142/312）。142例宫内感染的新生儿中，血清HBsAg阳性24例（7.7%，24/312），血清HBV DNA阳性61例，（19.6%，61/312），外周血单个核细胞中HBV DNA阳性81例，（26.0%，81/312）。其中有15例（4.8%，15/312）新生儿同时检测出血清HBsAg阳性和HBV DNA阳性，9例（2.9%，9/312）新生儿全部检测结果均阳性。
　　（2）HBsAg阳性母亲发生新生儿HBV宫内感染的危险因素分析
　　综合312例HBsAg阳性母亲及其新生儿的临床流行病学数据、人口学调查数据及实验室检测结果进行分析，结果显示：170例（54.5%170/312）新生儿未发生宫内感染，142例（45.5%，142/312）新生儿发生宫内感染；母亲PBMC HBV DNA阳性100例（32.1%，100/312），其中67例发生宫内感染，33例未发生宫内感染，经卡方检验χ2=27.40，p＜0.001；母亲HBeAg检测阳性人数78例（25%，78/312）其中54例发生宫内感染，24例未发生宫内感染，经卡方检验χ2=20.82，p＜0.001；母亲血清HBV DNA阳性137例（43.9%，137/312），其中73例发生宫内感染，64例未发生宫内感染，经卡方检验χ2=5.95，p=0.0147；表明母亲PBMC HBV DNA、血清HBV DNA和HBeAg阳性是发生新生儿HBV宫内感染的危险因素，其它因素如分娩年龄、分娩方式、新生儿体重等均与 HBV宫内感染无关。进一步分析母亲血清中HBV DNA含量与新生儿HBV宫内感染的关系发现，血清中HBV DNA的含量越高，发生宫内感染的概率越大。血清HBVDNA含量高于106copies/ml的孕妇对比血清HBVDNA含量低于103copies/ml的孕妇，其新生儿发生宫内感染的相对危险度为5.33（95% CI为2.78~10.2）；血清HBV DNA在103copies/ml至106copies/ml之间的孕妇相对危险度为2.61（95% CI为1.07～6.38），经趋势卡方检验三组宫内感染率差异有统计学意义，χ2值为28.24，p＜0.001。
　　2.HBV DNA电转染PBMC实验
　　利用PCR成功提取出HBV DNA全基因组序列，经1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物条带与预期结果一致；连接转化后将提取的目的基因连接产物双酶切，其产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定；使用紫外分光光度计测得目的基因质粒浓度为20ng/ml；质粒通过电转染的方式转染健康人PBMC，培养6小时和24小时后的提取细胞DNA，利用荧光定量PCR方法检测细胞中HBV DNA的拷贝数，分别为5.67×103copies/ml和7.4×104copies/ml。
　　3.发生宫内感染新生儿PBMC细胞原位检测分析
　　利用原位PCR技术检测乙型肝炎患者PBMC细胞中HBV DNA的表达情况，以乙型肝炎患者肝组织石蜡切片为阳性对照，以核固红染色为背景颜色，肝组织和PBMC的细胞核中可以观察到蓝紫色团块；通过滚环扩增加跨缺口原位PCR技术对cccDNA进行检测，在肝组织和细胞的细胞核中发现有蓝紫色团块。在对孕妇PBMC中cccDNA原位检测的过程中发现，原位检测的阳性率与血清HBV DNA含量有相关性，通过对比74例样本发现，外周血HBV DNA含量高，PBMC中检测cccDNA的阳性率越高。25例外周血HBV DNA含量高于106copies/ml的患者中HBV cccDNA阳性43例（89.6%，43/48），26例外周血HBV DNA含量低于106copies/ml的患者中HBV cccDNA阳性12例（46.2%，12/26），经卡方检验χ2=16.7，p＜0.001；在针对62例母婴对的婴儿 PBMC原位检测结果汇总发现，25例发生宫内感染的婴儿，其中22例PBMC中cccDNA检测阳性，阳性率88%（22/25），fisher精确卡方计算结果显示p＜0.001。
　　结论：本研究发现，HBsAg阳性孕妇的血清HBeAg、血清HBV DNA和PBMC HBV DNA阳性为生新生儿宫内感染的高危因素，对婴儿PBMC中HBV DNA的检测有助于判断宫内感染的发生；通过转染乙型肝炎病毒至健康人外周血单个核细胞，通过荧光定量PCR和细胞原位PCR技术检测证实PBMC可以感染HBV。利用滚环扩增加跨缺口原位PCR技术检测新生儿PBMC中cccDNA证实宫内感染的发生与PBMC有关，被HBV感染的PBMC在发生新生儿HBV宫内感染的过程中发挥重要作用。

目录

声明

缩略词表

前言

第一部分 新生儿乙型肝炎病毒宫内感染危险因素分析

1. 概述

2. 材料与方法

2.1材料

2.2 主要试剂配制

2.3仪器

2.4试验方法

1. 312例HBsAg阳性孕妇其新生儿HBV感染情况

2. 新生儿HBV宫内感染的危险因素分析

3. 母亲血清HBV DNA含量与新生儿宫内感染的关系

4. 讨论

5. 结论

第二部分 外周血单个核细胞在HBV母婴传播中的作用研究

第一节 外周血单个核细胞转染HBV DNA

1. 概述

2. 材料、仪器与方法

3. 结果

4. 讨论

5. 结论

第二节 原位聚合酶链反应检测外周血单个核细胞中 HBV DNA和cccDNA

1. 概述

2. 材料、仪器与方法

3. 结果

4. 讨论

5. 结论

讨论

结论

参考文献

作者简介

致谢