海洋来源产紫青霉G59的新霉素抗性突变株4-30新产抗肿瘤活性产物研究

摘要

微生物代谢产物是新药及其先导结构的重要来源，其中真菌次级代谢产物因具有丰富的化学多样性倍受人们关注。然而在对野生真菌进行活性筛选时，绝大多数菌株因不具备相关的生物学活性而被弃置，造成了大量自然资源的浪费。微生物基因组学的研究表明，在常规的培养条件下，大多数次级代谢相关基因（簇）处于沉默状态，不能进行表达产生相应的次级代谢产物。近年来，本课题组围绕如何激活真菌中沉默的次级代谢途径，建立了一系列简便而有效的实验技术新方法，包括 DMSO介导的硫酸二乙酯诱变，超声介导的抗生素抗性导入，以及DMSO介导的抗生素抗性导入等。最近，本课题组又通过以无抗肿瘤活性的海洋来源产紫青霉 G59作为原始菌株，采用 DMSO介导的新霉素抗性筛选方法，获得了数十株具有抗肿瘤活性的新霉素抗性突变株。本文通过对 DMSO介导新霉素抗性筛选所得到的3株突变株进行抗性验证实验，对突变株的新霉素抗性导入情况进行确认。在此过程中，将新霉素抗性突变株4-30、PDN-10-2、PDN-v-2及其相应对照原始菌 G59的新鲜孢子液，用新霉素分别按筛选获取各突变株时处理G59孢子所采用相同实验条件进行处理，然后涂布于PDA培养基上，28℃培养并逐日观察。对比原始菌 G59与突变株在生长状态上的差别，发现原始菌G59的生长受到了明显的抑制，而突变株的生长则无明显抑制，表明突变株已获得了新霉素抗性，抗性筛选实验取得了成功。从课题组前期获得的突变株中挑选8株活性突变株，进行了抗肿瘤活性复筛，以考察突变株的活性稳定性。对8株新霉素突变株的发酵提取物进行HPLC分析，观察对比突变株与原始菌代谢产物的差异。最终，从这8株突变株中选择了活性稳定，代谢产物丰富并与原始菌G59差异明显的突变株4-30作为继续研究的对象。
　　对突变株4-30分别进行了液体培养基以及固体培养基的大量发酵，并从中选择性地分离在原始菌 G59中不产而在突变株中新产，且具有抗肿瘤活性的次级代谢产物。在对突变株4-30液体培养基大量发酵的研究中，首先进行了发酵时效考察的预实验，初步明确了发酵培养的最佳时间。在具体的产物分离过程中采用了化学分析检测引导活性追踪分离的手段，综合利用各种分离分析技术，从中获得了5个具有抗肿瘤活性的新产化合物（化合物1-5）。为了进一步考察突变株4-30的代谢能力，更加深入地挖掘突变株的新产活性次级代谢产物，我们对突变株4-30进行了固体培养基的大量发酵。产物分离采用与之前相同的策略，获得了4个具有抗肿瘤活性的新产化合物（化合物6-9）。综合应用现代波谱技术（UV、IR、CD、NMR等）以及改良Mosher方法对上述化合物1-9的结构进行阐明。化合物6为新结构化合物，属于自然界罕见的Cyclopentachromones(CPCs)类化合物，在其结构中存在一含硫侧链，并通过硫醚键的形式来与母核中脂肪环部分相连接，这样的结构在CPCs类化合物中尚属首次发现。根据HMBC谱中提供的信号，可知化合物6在五元环上取代基的位置也具有一定独特性，与之前所报道过的该类化合物取代的位置均不相同。通过对母核中远程 C-H偶合常数的分析，结合Karplus方程的计算，确定了骨架中C-2与C-3的相对结构，进一步通过计算简化结构 ECD，并与实验测量 CD进行比对分析，确定了五元环上的绝对构型。经改良Mosher法实验，确定了化合物6侧链C-17位连羟手性碳的绝对构型。通过对化合物6同类化合物生合成规律的分析，分别找出了骨架结构与侧链前体的来源，并对其可能的生合成途径进行合理的推测。
　　联合使用HPLC-PDAD-UV与HPLC-ESI-MS的分析方法，以上述分离得到的单体化合物1-9作为参照，对原始菌G59以及突变株4-30液、固体培养基发酵产物乙酸乙酯提取物在同样的实验条件下进行产物检测分析。实验结果显示，化合物1-9均在突变株4-30的发酵样品中检测到，而在原始菌G59的发酵样品中则没有检测到，表明化合物1-9均为突变株4-30中新产的次级代谢产物。这说明突变株4-30在引入抗性的过程中激活了原本在G59中沉默的次级代谢相关途径，根据所得到的化合物结构特点来看，这其中可能包括聚酮合成酶途径（PKS）以及非核糖体肽合成酶途径（NPRS）以及其它复杂的生合成途径。正是这些原本沉默的相关次级代谢合成途径的被激活，导致突变株4-30获得了可代谢产生原本在G59中所不能产生，且具有一定抗肿瘤活性的次级代谢产物的能力。
　　以人癌细胞K562、HL-60、BGC-823、Hela以及MCF-7作为受试对象，分别对单体化合物1-9进行初步抗肿瘤活性测试。100μg/mL浓度下化合物1-9对不同的肿瘤细胞作用24小时后，均显示出一定的抑制活性，抑制率介于27％~89%，相同浓度阳性参照5-氟尿嘧啶对肿瘤细胞抑制率介于42%~47%。化合物1-3,5-7,9还分别进行了IC50值的测试。其中新化合物6显示出了良好的抗肿瘤活性，对上述五种人癌细胞的IC50值介于16~75μM之间。
　　总之，通过 DMSO介导的新霉素抗性筛选，可以将原本无抗肿瘤活性的产紫青霉G59转化成具有抗肿瘤活性的突变株。随着突变株4-30新霉素抗性的引入，次级代谢相关途径较原始菌 G59发生了改变，因而可以从其代谢产物中分离得到结构新颖且具有抗肿瘤活性的化合物。这是一种对真菌次级代谢资源开发利用的新方法，在实验室条件下简便易行，对于拓展菌株药用资源，深入挖掘真菌次级代谢潜力相关工作具有重要的参考意义。

目录

声明

缩略词表

前言

一、确定天然有机化合物绝对构型的方法

二、激活真菌沉默次级代谢途径的方法

三、本论文研究方向与立题依据

第一章 原始菌产紫青霉G59及其8株新霉素抗性突变株的活性复筛、发酵产物的HPLC分析及3株突变株的新霉素抗性验证

1.1 抗肿瘤活性测试方法

1.2 原始菌G59及其突变株的来源

1.3 三株突变株的新霉素抗性验证实验

1.4 原始菌G59与8株突变株的发酵培养与提取物制备

1.5 突变株发酵提取物的活性复筛及代谢产HPLC分

1.6 目标菌株的确定

1.7 讨论与小结

第二章 新霉素抗性突变株4-30液体发酵新产抗肿瘤活性产物研究

2.1 发酵时效考察

2.2 大量发酵与提取制备

2.3 突变株新产抗肿瘤活性产物追踪分离

2.4 化合物结构鉴定

2.5 化合物1-5的新产检测分析

2.6 化合物1-5的抗肿瘤活性测试

2.7 讨论与小结

第三章 新霉素抗性突变株4-30固体发酵新产抗肿瘤活性产物研究

3.1 大量发酵与提取制备

3.2 突变株新产抗肿瘤活性产物追踪分离

3.3 含硫新结构化合物的结构解析

3.4 含硫新结构化合物的结构特点及其可能的生物合成途径

3.5 其他已知活性化合物的结构鉴定

3.6 化合物6-9的新产检测分析

3.7 化合物6-9的抗肿瘤活性测试

3.8 讨论与小结

第四章 实验部分

4.1 实验仪器、材料与试剂

4.2 有关第一章的实验部分

4.3 有关第二章的实验部分

4.4 有关第三章的实验部分

讨论与结论

参考文献

附图

个人简历

致谢