埃他卡林对体循环、脑循环、肺循环微动脉内皮细胞SUR2B/Kir6.1通道的激活作用及能量代谢物质的调节作用

摘要

在高血压病的情况下，全身的血管持续承受过高灌注压，容易造成整个循环系统的病变，诱发诸多心血管疾病，对人类健康形造了极大的威胁。血液在小动脉和微动脉中流动时，其受到的阻力远大于主动脉和容量血管等直径较大的血管，所以人类的动脉总压力降当中的绝大部份存在于微循环中的微动脉和微静脉之间，因此微动脉是阻力血管的主要组成部分。高血压病的最基本的病理机制即是微小动脉的异常收缩，管壁对血液流动的阻碍作用增加，最终导致血压升高。但遗憾的是目前临床所使用的高血压药物当中，扩血管类药物普遍不具备阻力血管选择性，对大中血管的影响引起了一系列不良反应的发生。
　　ATP敏感性钾通道（KATP）开放剂因其强大的扩血管作用被广泛研究并用于高血压的治疗。在不同组织中，KATP通道亚型的组成和分布不同，功能各异，是细胞膜上可以偶联细胞兴奋性和能量代谢的一类重要分子。其SUR2B/Kir6.1和SUR2B/Kir6.2是血管上存在的主要KATP亚型，SUR2B/Kir6.1在微小血管表达尤其丰富，选择性激活SUR2B/Kir6.1亚型的KATP可以达到扩张阻力血管而同时不影响主动脉和容量血管的目的，有效避免了其他 KATP开放剂因为同时作用于多种亚型因而在相应的组织当中产生的毒副作用。
　　埃他卡林是我室研发的具有自主知识产权的新型 KATP通道开放剂。大量的前期工作已经证实埃他卡林降压作用显著，药效持续时间长而稳定，能够保护在高血压状态下极易受损的重要器官或组织，包括心、脑、肺、肾、心血管等，减轻胰岛素抵抗。埃他卡林的降血压作用具有高血压状态选择性，能够降低患有高血压病的动物和患者的血压，而不影响正常人和动物的血压。埃他卡林产生上述治疗作用的主要机制是基于强效的血管内皮保护作用。近期结果显示，埃他卡林能够选择性舒张高血压状态下的阻力血管而对大血管无明显影响，这种调控作用可被格列本脲（KATP特异性阻断剂）所拮抗，在去处内皮组织的微动脉环上，埃他卡林的舒张作用大幅减弱，只有完整微动脉环的30％左右。这一结果进一步提示了埃他卡林发挥的靶向阻力血管的降压作用主要是由内皮细胞上的KATP所介导。而异源表达不同亚型 KATP通道的实验结果证实，埃他卡林能够高选择性的开放SUR2B/Kir6.1亚型的KATP通道。因此，本文第一部分采用电生理学结合细胞内微灌流的方法，就埃他卡林对于构成阻力血管的两种细胞，即平滑肌细胞和内皮细胞上KATP的开放作用特点以及确切的分子靶标进行深入研究。
　　我们发现在急性分离的大鼠肠系膜微动脉平滑肌细胞上给予埃他卡林10-8、10-7、10-6、10-5、10-4和10-3mol/L时，给药后全细胞电流的幅度分别为给药前的（96.91±3.05）%、（111.89±1.93）%、（127.07±8.6）%、（148.27±6.87）%、（195.48±12.32）%和（190.12±19.42）%（n=6），在给予格列本脲10-6mol/L后，电流幅度降低至（89.76±2.63）%（n=6）。在Kir6.1基因敲除小鼠模型上，埃他卡林能够激活野生型（WT）小鼠肠系膜微动脉平滑肌细胞KATP：给予埃他卡林10-6、10-5、10-4mol/L，全细胞电流分别增加至（119.25±4.08）%、（134.04±1.92）%和（180.98±14.86）%（n=6），该电流可被格列本脲拮抗至（89.72±5.51）%（n=6）。在杂合子（Kir6.1+/-）小鼠的实验中，埃他卡林的激活作用仍然存在：给予埃他卡林10-6、10-5、10-4mol/L，电流幅度显著增大，分别是给药前的（126.62±8.84）%、（149.44±5.88）%和（205.42±24.22）%（n=6），给予格列本脲后电流幅度减小为（94.06±2.22）%（n=6）。埃他卡林高剂量（10-4mol/L）在纯合子（Kir6.1-/-）小鼠上并未引起全细胞电流幅度的改变。结果表明埃他卡林对阻力血管的作用确实是由激活SUR2B/Kir6.1亚型的KATP通道所介导。
　　在大鼠肠系膜微动脉内皮细胞上，埃他卡林和吡那地尔激活 KATP的作用均依赖于胞内能量物质 ATP、ADP、UDP的存在。埃他卡林在胞内 ATP、ADP、UDP浓度为100~1000μM时才产生显著的激活作用，而吡那地尔在内灌ATP浓度在10~5000μM，ADP、UDP浓度为10~3000μM的情况下，均可产生激活作用，提示埃他卡林对于细胞所处的能量状态具有选择性。镁离子对埃他卡林和吡那地尔激活大鼠肠系膜微动脉内皮细胞 KATP的作用都是必要的。对埃他卡林而言，不水解的ATP衍生物ATPγs不能替代ATP支持其开放KATP通道的功能，而ATPγs存在时，吡那地尔的开放作用较 ATP存在时显著增强。这表示吡那地尔的激活作用是基于ATP的配体作用，埃他卡林开放肠系膜微动脉内皮细胞KATP通道则依赖ATP的水解。
　　以缺血、缺氧损伤为病理基础发生发展形成的各种血管疾病是非常严重的健康和社会问题，可导致重要器官产生不可逆损伤，甚至死亡。脑卒中是脑血液的供给减少或中断直接导致脑缺氧缺血从而引起的神经功能障碍和脑血管疾病。在缺血缺氧性脑损伤过程中，脑微循环内皮细胞损伤直接导致血脑屏障功能遭受破坏，引起血管病变及脑水肿，进而引发神经元受损。慢性低氧性肺动脉高压的主要病理特点是肺血管痉挛和肺血管重构。低氧条件下的肺微小动脉剧烈收缩，其内皮细胞损伤是诱发肺动脉压升高的重要原因。因此,研究针对改善微小血管内皮功能的药物对治疗肺动脉高压意义十分重大。
　　近些年来，我们的研究成果表明埃他卡林在脑缺血、缺氧模型上有显著的神经保护作用，其治疗作用机制与KATP高度相关。在内皮素-1诱导的或者低氧所致的肺动脉高压模型上，埃他卡林对肺微动脉具有明显的剂量依赖性的扩张作用，同时可以逆转肺小动脉重构，改善肺微动脉内皮功能。脑、肺微动脉内皮细胞上均有KATP表达，该通道的开放受细胞内ATP/ADP调控，在多种组织和细胞中具有抗缺血/缺氧损伤的内源性保护作用。
　　第一部分的实验结果证实埃他卡林能够直接激活体循环阻力血管内皮细胞上SUR2B/Kir6.1亚型的KATP，其激活作用与细胞能量代谢状态相关，于是本文的第二、三部分就埃他卡林能否在脑循环、肺循环的微动脉内皮细胞上实现其保护作用，为能量代谢异常导致的血管疾病提供一种可能的治疗途径进行初步探索。
　　我们采用与肠系膜微动脉内皮细胞上相同的实验方法发现：埃他卡林在ATP、ADP、UDP浓度为1000μM时可显著的激活脑微动脉内皮细胞 KATP。在肺微动脉内皮细胞上，在ATP浓度为100~1000μM、ADP浓度为30~1000μM、UDP浓度为100~1000μM时，埃他卡林可产生激活作用。在胞内无镁离子存在以及内灌 ATPγs两种实验情况下，埃他卡林不激活脑、肺微动脉内皮细胞上的KATP。
　　综上所述，本文结论如下：
　　1埃他卡林可以浓度依赖性的开放阻力血管平滑肌细胞KATP通道，起效浓度为10-7 mol/L，在10-4 mol/L时作用最强，并且是选择性作用于KATP通道 SUR2B/Kir6.1亚型的。
　　2埃他卡林能够开放大鼠肠系膜、脑、肺微动脉内皮细胞的KATP通道，开放作用均依赖于胞内能量物质 ATP、ADP、UDP、Mg2+的存在且具有显著的细胞能量状态选择性，与ATP的水解作用相关。
　　3作用于脑微动脉内皮细胞KATP时，埃他卡林的激活作用最强，且药物起效所需的能量物质浓度范围明显窄于其它两种内皮细胞，仅在ATP、ADP或者UDP浓度为1000μM时才产生显著的激活作用，在能量物质处于其他浓度时均不进一步激活细胞的KATP，提示药物的脑保护作用与能量代谢有极高的相关性。

目录

声明

英文缩略词表

第一章 埃他卡林对体循环微动脉内皮细胞SUR 2B/Kir

前言

材料与方法

结果

讨论

结语

第二章 埃他卡林对脑循环微动脉内皮细胞SUR 2B/Kir

前言

材料与方法

实验结果

讨论

结语

第三章 埃他卡林对肺循环微动脉内皮细胞SUR 2B/Kir

前言

材料与方法

实验结果

讨论

结语

结论

参考文献

综述：ATP敏感性钾通道在心血管疾病中的作用

论著

简历

致谢