中低频纯音强声对小型猪生物效应的研究

摘要

背景:高声压级的可听声首先直接作用于听觉系统，然后通过听觉器官再作用于中枢神经系统，而且随着暴露时间的延长，会引起一系列继发的神经系统的损伤。对于强声暴露引起的神经系统的紊乱和损伤，目前的研究结论多建立在强噪声暴露的临床经历和啮齿类动物模型的实验基础上。而对于纯音强声、尤其是中低频纯音强声的生物效应尚研究较少。就强声暴露对神经系统损伤的机理而言，目前的研究主要集中在脑区的神经递质和相关受体的合成、释放和转运等方面。对于影响脑区神经递质和相关受体的机制研究较少，参与介导的信号通路尚未明确阐明。海马和皮层的神经元突触,如果长时间维持增强的诱导、可导致突触敏感化，引起神经递质含量减少，从而影响正常的神经系统的功能。其最为突出的表现是空间学习能力和记忆能力下降，但是目前强声暴露对海马和皮层神经元递质及受体的作用机制尚不清楚。因此，本课题以巴马小型猪为研究对象，系统的观察了中低频纯音强声暴露对中枢神经系统损伤的特点，并初步探讨了强声可能致海马和皮层神经元损伤的分子机制，为进一步阐述强声致神经损伤的相关机理提供了参考。
　　材料和方法:实验动物以巴马小型猪作为研究对象。所有实验动物饲养于军事医学科学院实验动物中心，饲养条件相同。30只巴马小型猪随机分为3组：空白对照组，900 Hz-130 dB强声暴露组和900 Hz-142 dB强声暴露组。空白对照组小型猪不进入强声实验现场；130 dB强声暴露组采用900 Hz、130 dB强声刺激15 min；142 dB组采用900 Hz、142 dB强声刺激15 min。实验结束后每组随机抽取小型猪5只，麻醉后抽取静脉血10 ml，获取血液后将其处死，取出相同部位的部分海马和皮层组织，分别存放于液氮和4％的福尔马林溶液中。每组剩余的小型猪送回实验动物中心留观，一周后同法取样。
　　1、血清生化分析：获得的静脉血凝血后2000 rpm室温离心10 min，取上层血清，使用全自动血液分析仪对小型猪各血清样品生化指标进行检测，检测内容包括血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）、肌酸激酶（CK）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）、乳酸脱氢酶（LDH）、γ-羟丁酸脱氢酶（γ-HBDH）、总胆汁酸（TBA）、超氧化物歧化酶（SOD）、γ-谷氨酰转肽酶（γ-GT）、碱性磷酸酶(ALP)、亮氨酸氨肽酶（LAP）等。
　　2、血清神经内分泌激素分析：获得的血清，按照相应激素的检测试剂盒说明书提供的实验步骤，采用ELISA方法对血清中不同激素的含量进行检测。检测的激素包括促肾上腺皮质激素（ACTH）、血清皮质醇（CORT）、促肾上腺皮质激素释放激素（CRH）、C-反应蛋白（CRP）、去甲肾上腺素（NE）、脑红蛋白（NGB）、神经肽P（NPP）、神经肽Y（NPY）、神经元特异性烯醇化酶（NSE）、血清S100-b等。
　　3、脑组织形态学观察：将固定后的组织样品依次进行梯度脱水、石蜡包埋后进行石蜡切片，切片厚度4μm，切片后进行HE染色，封片后于显微镜下观察并拍照。
　　4、钙离子浓度分析：OTC包埋组织，冰冻切片机切片，加入Fluo-4进行染色、孵育并清洗后，在激光共聚焦显微镜下观察钙离子的荧光信号，使用ZEN2011软件对钙离子浓度进行定量分析。
　　5、基因mRNA表达水平检测：液氮中冷冻组织经研磨后使用Qiagen试剂盒提取总的mRNA，总RNA定量后，逆转录成cDNA；针对PKC、PI3K和CACNA2D1基因，选用合适的引物，采用Real-time PCR方法定量分析上述基因表达水平。
　　6、PKC和Ca2+受体蛋白表达水平检测：将液氮中冻存冷冻的组织充分裂解后，提取组织蛋白，然后进行蛋白电泳和蛋白转印。PKC和Ca2+受体特异的抗体4℃孵育过夜，洗膜后，二抗室温孵育60 min，最后进行暗室显影，对PKC和Ca2+受体蛋白表达进行定量分析。
　　实验结果:巴马小型猪分别暴露在900 Hz-142 dB和900 Hz-130 dB的中低频纯音强声条件下15分钟后均出现明显的行为异常，表现为：小型猪大部分采取背对强声发生装置的姿势，出现兴奋性增强，局促不安，撞笼等现象，个别小猪出现了小便失禁,无法自主站立或前肢跪下等行为异常反应，对锐器刺激反应不敏感。以上异常行为提示有神经系统损伤。
　　900 Hz-142 dB和900 Hz-130 dB强声暴露15分钟后和暴露后一周血清指标显示：（1）血清中SOD的含量都明显增加；血清中CK含量都明显下降；（2）血清中CRP含量都明显上升，而血清中NE和LDH、CK-MB、ALP、γ-HBDH含量都明显下降；（3）900 Hz-130 dB强声暴露15分钟后血清中CORT和α-HBDH含量下降；900 Hz-142 dB强声暴露15分钟后血清中NSE含量升高，血清中（γ-GT）含量下降；（4）900 Hz-142 dB强声暴露一周后血清中NPY和TBA含量上升；此外，短时间的强声暴露对血清中ACTH、CRH、NGB、NPP、S100-β、LAP的含量没有明显的影响。以上结果提示SOD、NSE和CK有可能作为强声对神经系统损伤的标志物。
　　小型猪脑组织形态学分析：海马组织HE染色显示：900 Hz-130 dB强声暴露组未见明显损伤样改变，900 Hz-142 dB强声暴露组可见海马组织出现明显的损伤样改变，部分颗粒细胞核明显固缩，细胞质空泡化，椎体细胞水肿较为明显，提示这部分细胞可能已经凋亡。
　　小型猪脑组织中钙离子浓度的定量分析显示：与空白对照组相比，900 Hz-142 dB强声暴露组可见海马组织中钙离子浓度明显增加，而在皮层组织中，钙离子浓度明显下降。
　　小型猪脑组织中PKC、PI3K和CACNA2D1基因mRNA表达水平检测：与空白对照组相比，900 Hz-142 dB强声暴露组海马组织中PKC、PI3K和CACNA2D1的mRNA出现明显上调；而在皮层组织中，强声暴露后PKC、PI3K和CACNA2D1的mRNA出现明显下调。
　　小型猪脑组织中PKC和Ca2+受体蛋白表达水平检测：与空白对照组相比，900 Hz-142 dB强声暴露组的海马组织中，PKC和钙离子受体的表达明显增加；而在皮层组织中，PKC和钙离子受体的表达明显下降。
　　结论:综上所述，本研究发现900 Hz-142 dB和900 Hz-130 dB的中低频纯音强声暴露15分钟后，小型猪出现异常行为反应。900 Hz-142 dB和900 Hz-130 dB强声暴露组可见血清中部分生化分子和神经内分泌激素发生不同程度的变化，其中NSE和SOD明显升高、CK含量明显下降，提示SOD、NSE和CK有可能作为强声对神经系统损伤的标志物。900 Hz-142 dB短时间的强声刺激可引起大脑海马组织损伤样改变，而皮层组织结构影响未见明显异常。15分钟900 Hz-142 dB中低频纯音强声刺激作用于海马组织，通过激活PI3K、PKC信号通路，引起CACNA2D1的表达上调，引起海马组织细胞内钙离子含量增加；而在皮层组织中，强声刺激则抑制PI3K、PKC信号通路，下调CACNA2D1的表达，从而使皮层组织细胞中钙离子含量减少。以上结果不仅揭示了强声引起神经损伤的可能机制，同时也为防治强声对神经系统造成的损伤提供了新的思路。

目录

声明

缩写词表

前言

材料与方法

1. 实验材料

2. 实验方法

实验结果

1. 强声暴露期间小型猪行为表现

2. 经不同强度强声暴露后小型猪的血液生化分析结果

3. 强声对小型猪血清神经内分泌激素的影响

4. 强声对小型猪大脑海马和皮层结构的影响

5. 强声对海马组织中钙离子及信号通路的影响

6. 强声对皮层组织细胞中钙离子及信号通路的影响

讨论

1. 声音参数的选择：

2. 强声对小型猪神经内分泌激素的影响

3. 强声对小型猪海马细胞内钙离子变化及其信号通道的影响

4. 强声对小型猪皮层组织细胞内钙离子变化及其信号通道的影响

结论

参考文献

附录 I

附录II

个人简历

致谢