新发及罕见侵袭性真菌病原体的基因组研究及分子诊断

摘要

侵袭性真菌感染((invasive fungal infection，IFI)是指侵犯皮肤角质层以下，粘膜、内脏器官及深部组织，在一定条件下可播散至全身的感染，包括真菌血症和深部组织感染。近30年来，由于艾滋病、肿瘤、糖尿病等免疫功能低下患者的增加，创伤性医疗操作、器官移植的增多，长期使用抗生素等因素，侵袭性真菌感染的发病率和死亡率显著上升，同时新突发的真菌侵袭病例也不断涌现。相比侵袭性真菌的来势凶猛，人们对它的研究还比较薄弱，真菌的基因组测序、分子诊断、药物开发都相对少于对病毒及细菌的研究。本课题通过对新发及疑难罕见真菌病原体进行全基因组测序分析和分子诊断方法的研究，从而达到全基因组数据的构建、近缘种属进化的探究、致病相关基因的发现、可能致病机制的推测、分子诊断标志物的预测等目的，为进一步进行预防、诊断、治疗等研究奠定基础。
　　本文建立了结合二、三代测序数据进行新发及罕见侵袭性病原真菌基因组de novo拼接及深度解析致病因子的方案。对于新发的侵袭性致病真菌胶囊青霉（Penicillium capsulatum）和伊蒙菌新种（Emmonsia sp.5z489）在无参考基因组的情况下，首次测得他们的全基因组序列，进行从头拼接，得到了完整度很高的基因组图谱，并对它们及近缘菌进行了毒力因子的解析和进化研究。2011年以来，以Illumina MiSeq和HiSeq为代表的第二代测序技术迅速发展，极大提高了测序通量，缩短了测序时间，降低了测序成本，基因组学研究迎来了革命性突破。但是二代测序读长比较短，这就增添了后期的序列拼接、注释、比对等生物信息学分析的难度，尤其对于有较多重复序列的真核生物基因组的从头拼接。以Pacbio RSII为代表的第三代测序技术具有长读长的优势，在基因组测序中能够成功跨越重复区，降低了测序后基因组拼接、分析的工作量。但是，第三代测序的错误率相比一代和二代都要显著增加，单碱基错误率可达到10~15％。可见这些测序技术各有不同的优势与缺憾，所以对于不同的基因组研究目的，需要选择合适的测序方案。本研究建立了二、三代测序数据融合的方案解决了新发及罕见致病性真菌基因组的从头拼接难题，并深入分析其遗传信息，取得了较好的效果。
　　胶囊青霉属于散囊菌目青霉属，它曾用于工业造纸，以往未见到有致病性报道。青霉属真菌在人们的日常生活中起着非常重要的作用，极少对人致病。本研究所涉及的胶囊青霉更是鲜见的由青霉引起深部侵袭性感染的案例。2013年我国真菌学家首次在一位II型糖尿病人肺部发现胶囊青霉感染的菌团并进行分离培养。本研究通过将二代Illumina MiSeq测序平台与三代Pacbio RSII测序平台相结合的技术方案，绘制它的全基因组图谱，分析其系统进化，阐明了其中容易产生争议的分类进化关系，为分子进化研究提供了新的视角。并将其毒力相关因子分成7类：
　　1）与热耐受相关的毒力因子。
　　2）与细胞壁合成及结构相关的毒力因子。
　　3）与抵抗人体免疫系统相关的毒力因子。
　　4）与毒素分泌相关的毒力因子。
　　5）与侵袭宿主过程中摄取营养物质相关的毒力因子。
　　6）与信号传导、适应人体环境相关的毒力因子。
　　7）与过敏原相关的毒力因子，进行了细致的分析，对如何研究一种新发侵袭性真菌的致病性提供了参考方案。
　　伊蒙菌是一种双相真菌，在环境中以菌丝相存在，在哺乳动物组织中则会形成酵母样细胞。伊蒙菌的宿主一般是啮齿类动物，侵袭人类从而引发深部感染的伊蒙菌是比较罕见的。但是近年来新英格兰医学连续报道了南非 HIV感染人群被伊蒙菌深部侵袭的病案，引发了人们的高度关注。我国首例伊蒙菌侵袭肺部的病案是由协和医院于2005发现的。患者曾被怀疑是肺结核，但相应治疗无效，经病原菌培养，通过形态学及ITS序列鉴定为是罕见的伊蒙菌深部感染，这个新种被命名为东方伊蒙菌，菌株号为Emmonsia sp.5z489。本研究首次将我国自主发现的这株侵袭性伊蒙菌新种进行全基因组测序。仍采用二代Illumina MiSeq平台与三代Pacbio RSII平台相融合的方案，结合了两者短序列深度测序和长序列测序跨越重复区的优势，可以达到高完整度和可信度的拼接结果，并基于病原体与宿主之间相互作用的毒力因子数据库（Pathogen-Host Interaction database，PHI)进行这一新种的毒力因子分析。进而将我国新发现的侵袭性伊蒙新种Emmonsia sp.5z489与国际上报道的3种侵袭性伊蒙菌进行比较，重点分析毒力因子的异同和进化关系。发现这株东方伊蒙菌Emmonsia sp.5z489与南非Emmonsia sp.CAC-2015的进化关系最近，它们都是侵袭人类的致病菌。而另外两株感染动物的伊蒙菌进化关系较远，且毒力因子的数量也少于人类致病菌。并且利用基因组数据所做的进化研究发现分离自挪威一只仓鼠身上的致病伊蒙菌Emmonsia parva是与芽生菌（Blastomyces）分在一个属，这也是近年来对伊蒙菌分类争议的一个焦点，我们的研究为国际真菌学家要求重新对Ajellomycetaceae菌科伊蒙菌属进行分类提供了一定的依据，同时也为进一步研究侵袭动物和人的病原菌演变进程、致病机制提供了数据基础。
　　隐球菌脑膜炎是一种非常严重的中枢神经系统疾病，预后不良，死亡率高。致病菌主要是新生隐球菌，通常感染的是免疫缺陷人群。但从1999年以来，在加拿大不列颠哥伦比亚省、温哥华岛和美国北部等地区发现人类隐球菌感染的暴发流行，其病原菌不是新生隐球菌，而是格特隐球菌，这种格特隐球菌可引起免疫正常人群罹患肺炎和脑膜炎，从而越来越受到全球范围的重视。而我国有关格特隐球菌致病机理的研究数据相对较少，更鲜有基因组的报道，国内首例格特隐球菌是1980年由长征医院真菌学家廖万清教授报道的。本研究所获得格特隐球菌也是由廖万清院士团队从隐球菌脑膜炎患者的脑脊液中分离培养得到的病原菌，本研究将其进行深度测序，全基因组拼接，并基于病原体与宿主之间相互作用的毒力因子数据库进行毒力因子分析。
　　由于侵袭性真菌病具有发病隐匿、临床表现易被基础病掩盖、病死率与致残率高等特点，早期、准确的诊断对于及时救治意义重大。致病菌的分离培养、表型鉴定是临床上确诊IFI的主要依据。但真菌培养耗时长，某些病原菌生长条件苛刻，培养过程中容易被其他环境菌污染，并且对于己使用抗感染药物的患者培养结果假阴性率很高。而分子诊断具有高效、及时、准确的特点，为侵袭性真菌的早期诊断提供了有力的依据。但是以往的分子诊断主要是依靠单个或多个序列的PCR实验来鉴定，这样的技术已经不能满足判定新发及罕见真菌感染的需求。本研究首次利用新一代测序技术对不可培养的疑难真菌侵袭病例进行直接“从样本到序列”的宏基因组测序方案进行全部序列信息的扫描，并进一步用单细胞测序技术分离可疑病原体进行测序、拼接、比对。最终得到了比较可靠的诊断结果，对临床治疗进行了有效的指导，并对如何鉴定不可培养的疑难真菌病原体提供了一个新的研究方法。
　　综上所述，测序技术突飞猛进的发展为医学带来了更广阔的发展前景。侵袭性真菌的来势凶猛提示我们要以更先进更精准的方法去认识、预防、诊治深部真菌感染。本课题利用二、三代测序技术，通过对新发及罕见侵袭性真菌病原体的基因组研究及分子诊断，为加深对真菌致病机制、进化演变的认识，推动真菌感染诊断技术的发展提供了新的技术方案和研究视角。

目录

声明

缩略词表

前言

一、研究背景

二、本研究的目的意义及应用价值

三、本研究的总体思路及技术路线

第一部分 新发致病性胶囊青霉基因组研究

一、概述

二、材料

三、方法

四、结果

五、讨论

第二部分 新发致病性伊蒙菌的基因组研究

一、概述

二、材料

三、方法

四、结果

五、讨论

第三部分 罕见致病性格特隐球菌基因组研究

一、概述

二、材料

三、方法

四、结果

五、讨论

第四部分 应用测序技术诊断难以培养和确证的特殊致病真菌

一、概述

二、材料

三、方法

四、结果

五、讨论

全文总结

参考文献

在学期间发表论文

个人简历

致谢