异肽键稳定的N肽类MERS-CoV融合抑制剂初步探索

摘要

自2012年至今，一种新型的人兽共患冠状病毒中东呼吸综合征病毒(Middle East Respiratory Syndrome Corona Virus，MERS-CoV)相继在中东、欧洲及亚洲南韩地区爆发，造成1600余人感染。该病致死率高达36％，并且目前尚无特异的治疗手段。因此，研发特异性药物，用于对抗MERS-CoV的高致病性和极强的传染性，成为当务之急。
　　MERS-CoV属于I类融合包膜病毒。该类病毒利用其包膜上的I类融合蛋白（Class I Fusion Protein）作为介导分子，与宿主细胞膜发生融合，是该类病毒感染的必须步骤。在这一过程中，融合蛋白跨膜亚基会发生分子内折叠，其N末端重复序列（NHR）和C末端重复序列（CHR）相互作用，形成六股α螺旋束（6-HB）结构。外加衍生于病毒NHR或CHR的肽片段，能够阻止上述6-HB的形成，进而抑制病毒与宿主细胞的融合过程，可以将包膜病毒阻止在宿主细胞膜外，并被身体的免疫防线清除，达到治疗的目的。已有研究表明，MERS-CoV CHR的多肽衍生物HR2P-6S具有一定的融合抑制活性和预防、治疗能力。而与之相反，NHR的衍生物HR1P却没有抑制活性。按照6-HB结构和机制的理论，NHR也是6-HB形成过程中的重要结构，与CHR互为作用靶点，其衍生物N肽可以在病毒融合时竞争结合CHR以干扰6-HB形成，达到抑制融合的目的。因此，对衍生于NHR的融合抑制剂（N肽）的开发，既能更进一步阐述MERS-CoV融合蛋白的作用机理，又有可能开发出新机制、新靶点的融合抑制剂。
　　目前在MERS-CoV的N肽类融合抑制剂开发中存在如下问题。与C肽不同，天然NHR所处的疏水环境复杂，表面较多的疏水残基导致N肽水溶性很差；加之从一级结构的角度观察，N肽序列亲/疏水残基交替出现，该一级结构更符合β折叠结构或水凝胶的特征，以上两点使N肽在体外很难重现出螺旋三聚体（N-trimer）这一活性高级结构，因而融合活性差；生理条件下极易聚集成凝胶甚至形成不可逆沉淀，使得N肽实验操作性差，开发难度高。以上问题普遍存在于各类包膜病毒的N肽类融合抑制剂的开发过程中。因此，本文的研究目的是，改善MERS-CoV N肽的理化性质，使其在体外重现N-trimer高级结构，并将其稳定在这一活性构象，以模拟天然MERS-CoV N-trimer分子结构，有利于进一步开发为N肽类融合抑制剂。
　　我们基于课题组前期研究基础，采用两种研究方法研究探讨MERS-CoV融合抑制剂。第一种方法是利用辅助序列修饰N肽，以诱导N肽组装成三螺旋，并用链间异肽键稳定N-trimer。IZm是人工设计的多肽序列，该序列富含亲水残基，将IZm嵌合于N肽序列，可以提高N肽水溶性，削弱N肽聚集成水凝胶的倾向；IZm的a、d位点是异亮氨酸，b、f位点以及e、g’位点为谷氨酸和赖氨酸，因此可以诱导N肽形成α-螺旋，并加强N肽自组装成三聚体的倾向。在此基础上，利用生理条件下的酰基转移反应，使N-trimer肽链之间邻近的e、g’位点的赖氨酸残基侧链与谷氨酸残基侧链间定点形成异肽键，从而构建异肽键稳定的辅助序列修饰N-trimer分子。
　　第二种研究方法是使用三螺旋形成策略和异肽键形成策略以稳定N-trimer的结构。研究表明在α-螺旋的i/i+3位、i/i+4位加强相互作用能够增强螺旋度；在α-螺旋的a、d位点引入异亮氨酸（Ile）能使螺旋具有自组装成三聚体的倾向；在螺旋三聚体链间邻近的e、g’位谷氨酸-赖氨酸离子对能进一步稳定该高级结构。因此，我们在N肽上不与CHR作用的b、c、f位点突变引入能形成离子对的谷氨酸（Glu）和赖氨酸（Lys），以提高多肽的螺旋度和水溶性；在a、d位点引入异亮氨酸，提高N肽形成N-trimer的能力；并在此基础上引入了链间异肽键来代替e、g’位的离子键，形成由异肽键稳定的天然N-trimer分子。
　　我们采用肽链上谷氨酸残基的功能基团羧基与苄硫醇形成活泼酯来活化赖氨酸，使氨基亲核进攻羰基碳形成异肽键。用正交保护的合成策略在树脂上完成硫酯修饰。交联位点的Glu用烯丙氧基保护侧链的L-谷氨酸参与多肽Rink Amide树脂经典Fmoc固相合成。肽链N-末端乙酰化封端后，双甲酮与三苯基膦[Pd]0盐避光正交脱除烯丙氧保护基。暴露出的羧基与苄硫醇在EDC/HBTU催化下缩合成活泼酯。然后TFA裂解去除树脂和其余保护基团，纯化并冻干。之后将纯肽溶解在含10%乙腈，pH=7.2的10mM PBS溶液中。乙腈提供了天然状态下膜肽的脂环境，使多肽能够形成正确结构；弱碱性离子条件活化了硫酯基团的酰基转移反应。
　　共价交联反应用反相-高效液相色谱（RP-HPLC）监测和纯化，产物由基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱仪（MALDI-TOF-MS）或电喷雾离子化质谱（ESI-MS）确证。圆二色谱（CD）测定多肽的二级结构，并采用细胞-细胞融合实验评价N肽的融合抑制活性。
　　RP-HPLC与MALDI-TOF-MS结果显示，我们成功构建了由异肽键稳定的MERS-CoV NHR衍生物N-trimer分子。由于共价交联前后N肽的化学环境发生变化，异肽键稳定的N-trimer色谱保留时间相比N肽单体较短，该现象与本课题组前期研究相符。CD结果显示，相较天然N肽序列HR1P，辅助序列修饰的N肽二级结构有所改善。
　　综上，我们在11个多肽序列的基础上进行了共价交联，通过异肽键的形式在生理条件下成功构建了共价稳定的MERS-CoV N-trimer模型。虽然该模型可以为中东呼吸综合征冠状病毒融合蛋白跨膜亚基的体外N端三螺旋构建提供参考，但是作为融合抑制剂，该分子在细胞-细胞融合模型活性测试中未表现出期望的高活性，IC50值在25μMol/L以上，尚需进一步研究改进。另外，我们在课题组前期工作基础上进一步验证了该异肽键形成方法的普适性，该异肽键形成方法可以为其它螺旋三聚体模型的构建提供参考。

目录

声明

缩略词表

第1章 前 言

1.1.1 MERS-CoV的基本信息

1.1.2 MERS-CoV流行事件

1.1.3 MERS-CoV的前沿研究

1.2 肽类融合抑制剂的研究进展

1.2.1 C肽类融合抑制剂

1.2.2 N肽类融合抑制剂

1.3 课题的提出、设计和研究方法

第2章 基于人工序列修饰的MERS-CoV N肽异肽键修饰

2.1 多肽序列设计

2.2 实验部分

2.2.1 试剂与仪器主要试剂及处理：

2.2.2 多肽合成与纯化

2.2.3 异肽键的形成

2.2.4 二级结构表征

2.2.5 细胞-细胞融合活性

2.3.1 多肽理化性质得到改善

2.3.2 多肽序列合成及共价三螺旋结构的成功构建

2.3.3 抑制活性及本章讨论

第3章 基于天然MERS-CoVN肽序列的定点突变和异肽键修饰

3.2 实验部分

3.2.1 试剂与仪器

3.2.2 多肽合成与纯化

3.2.3 异肽键的形成

3.2.4 二级结构表征

3.2.5 细胞-细胞融合活性

3.3.1 多肽理化性质得到改善

3.3.2 多肽序列合成及共价三螺旋结构的成功构建

3.3.3 抑制活性及本章讨论

结论

参考文献

附录

致谢

个人简历