欧前胡素和异欧前胡素的体内外代谢研究

摘要

欧前胡素（Imperatorin，IMP）和异欧前胡素（Isoimperatorin，ISOIMP）是呋喃香豆素类活性物质，二者互为同分异构体。它们广泛存在于白芷、独活和北沙参等伞形科药用植物中，是这些中药的主要药效成分，也是藿香正气水，龙葵银消片和元胡止痛片等多种临床广泛使用的中药制剂的重要活性成分，具有消炎镇痛、抗肿瘤和抗菌抗病毒等药理活性。
　　本课题以IMP及其活性代谢产物独活素（Heraclenin，HER）、花椒毒酚（Xanthotoxol，XANT），ISOIMP及其活性代谢产物氧化前胡素（Oxypeucedanin，OPE）和水合氧化前胡素（Oxypeucedanin hydrate，OPEH）为研究对象，建立并验证了同时检测生物样品中6种呋喃香豆素类活性成分的液相色谱-质谱联用（LC-MS/MS）方法。在此基础上，开展IMP和ISOIMP的大鼠血浆药代动力学研究，尿液、粪便和胆汁排泄研究以及组织分布研究，同时考察代谢产物的生成动力学和排泄。在体外肝微粒体和重组人源CYP酶孵育体系中，研究了IMP和ISOIMP肝微粒体代谢消除动力学、酶动力学和 CYP酶代谢表型，为IMP和ISOIMP的进一步开发、以及临床安全有效用药提供指导和依据。
　　本课题首先建立了LC-MS/MS定量检测方法，样品处理采用蛋白沉淀法，以茴芹内酯（Pimpinellin，PIM）为内标，采用CAPCELL PAK MG II C18（2.0×100mm，3μm）色谱柱，以乙腈（0.1％甲酸）-水（0.1%甲酸，5mM甲酸铵）梯度洗脱方式，有效分离了原型化合物和代谢产物。应用Agilent6410B型三重四级杆串联质谱仪，在电喷雾离子源、正离子多反应监测模式下对化合物进行定量分析。生物样品的方法学验证结果表明，该方法在2-2000 ng/mL的浓度范围内线性关系良好（线性相关系数R2＞0.9900）、最低定量限（Lower limit of quantitation，LLOQ）为2ng/mL，回收率大于90%，准确度（RE%）和精密度（RSD%）小于±15%，基质效应和稳定性能满足药代动力学的要求。此方法快捷简便，适用于大量样品的快速分析。
　　大鼠单次灌胃30mg/kg IMP后，原药的血浆浓度在1 h达到峰值，随后迅速消除，t1/2为1.5h，血药浓度-时间曲线下面积（AUC）为5078±3512ng·h·mL-1，血浆中检测到代谢产物HER和XANT；大鼠静脉注射2mg/kg IMP后，原药代谢消除迅速，t1/2为0.99h，AUC为731.2±67.3ng·h·mL-1，血浆样品中仅检测到产物HER，大鼠口服IMP的绝对生物利用度为46.3%。大鼠单次灌胃10mg/kg ISOIMP后，原药的血药浓度在0.8h达峰，t1/2为1.7h，AUC为396.3±200.5ng·h·mL-1；静注2mg/kg ISOIMP后，原药在血浆迅速消除，t1/2为0.59h，AUC为429.±72.1ng·h·mL-1；灌胃和静注给药血浆中均能检测到代谢产物OPE和OPEH，大鼠口服ISOIMP的绝对生物利用度为18.4%。
　　大鼠灌胃30mg/kg IMP后，原药在尿液、粪便和胆汁的72 h累积排泄率分别为0.018%、1.16%和0.0085%，尿粪总排泄率为1.18%，提示IMP在大鼠体内发生广泛的代谢，主要以产物形式排泄；产物HER的尿、粪和胆汁排泄量极少；XANT以游离、葡萄糖萄醛酸和硫酸结合物的形式从尿液和胆汁排出，72h的尿和胆汁累积排泄率分别为0.98%和5.75%，但粪便中未检测到XANT。大鼠灌胃30mg/kg ISOIMP后，原药在尿液和胆汁中的排泄量极低，而粪便的72 h累积排泄率为34.7%，提示其口服吸收不完全；产物OPEH以原型、葡萄糖醛酸和硫酸结合物的形式从尿液、粪便和胆汁中排出，72h的累积排泄率分别为0.033%、0.054%和0.68%；另一产物 OPE在尿、粪和胆汁中的排泄量很低。上述结果表明，本课题检测的活性产物都不是主要的排泄产物，IMP和ISOIMP在体内可能转化成其它产物后排泄。
　　大鼠灌胃10mg/kg IMP后，分别于0.5h、2h和6h取心、肝、脾、肺、肾和脑等重要组织器官，测定药物的组织浓度。结果表明，IMP能迅速并广泛地分布到组织器官中，大部分组织的药物浓度在0.5h达到峰值，组织和血浆的药物浓度由高到低的排序是：肝＞肾＞心＞脑＞肺＞脾＞血浆，其中肝脏的分布浓度显著高于血浆和其它组织。大鼠灌胃10mg/kg ISOIMP后，大部分组织的药物浓度在2h时达到最高，各组织和血浆药物浓度由高到低的排序是：肝＞肾＞心＞脑＞脾＞肺＞血浆，肝脏中的药物暴露水平显著高于血浆和其它组织。
　　在人和大鼠肝微粒体中，IMP和ISOIMP主要发生CYP酶介导的I相代谢消除。IMP在人和大鼠肝微粒体30min的代谢转化率分别为69.7%和94.5%，消除半衰期t1/2分别为（18.9±0.6）和（2.85±0.37）min，经外推得到的肝脏清除率CLh是（16.9±0.1）和（51.9±0.4）mL·min-1·kg-1，肝微粒体表观酶动力学参数Km分别为（13.6±0.16）和（14±0.24）μmol/L，Vmax分别为（2928±96）和（8434±27）nmol·min-1·g-1。ISOIMP在人和大鼠肝微粒体10 min的代谢转化率分别为82.7%和96.6%，t1/2分别为（4.94±0.31）和（2.27±0.25）min，CLh为（19.6±0.1）和（52.6±0.3）mL·min-1·kg-1；表观Km分别为（15.2±0.6）和（16.7±0.4）μmol/L，Vmax分别为（3677±105）和（11423±371）nmol·min-1·g-1。肝微粒体代谢动力学参数表明，IMP和ISOIMP在人和大鼠肝微粒体中的代谢消除迅速，且大鼠的代谢速率高于人；ISOIMP的代谢消除比IMP快，这可能也是ISOIMP绝对生物利用度低于IMP的原因之一。
　　代谢表型研究表明，IMP和ISOIMP在肝微粒体的I相代谢是由多个CYP同工酶介导的，CYP1A2、CYP2B6、CYP2C19和CYP3A4是参与两个活性化合物代谢的主要同工酶，经整体归一化法得到它们对IMP的代谢贡献率分别是20.4%、7.3%、10.5%和61.8%，对ISOIMP的代谢贡献率分别是34.8%、18.3%、13.6%和33.4%。
　　综上所述，IMP和ISOIMP在大鼠口服吸收快，可在肝脏分布富集，暴露水平显著高于血浆和其它组织，它们代谢消除迅速，主要经CYP酶介导代谢，以代谢产物的形式排泄。IMP和ISOIMP的体内代谢清除快、消除半衰期短，药物开发需考虑提高其代谢稳定性。根据本研究结果，结合IMP和ISOIMP可以显著抑制CYP酶活性的前期研究资料，建议IMP和ISOIMP临床应用时应关注药-药相互作用的风险。

目录

声明

英文缩略词表

实验材料

1 药品与试剂

2 仪器与设备

3 实验动物

前言

第一章 生物样品中欧前胡素和异欧前胡素及其代谢产物的定量分析方法建立与验证

第一节 LC-MS/MS定量检测方法的建立

第二节 定量分析方法学的验证

本章小结

第二章 欧前胡素和异欧前胡素及其产物的大鼠药代动力学

第一节 欧前胡素及其代谢产物的大鼠血浆药代动力学

第二节 异欧前胡素及其代谢产物的大鼠血浆药代动力学

本章小结

第三章 欧前胡素和异欧前胡素的排泄和组织分布

第一节 排泄和组织样品定量分析方法的部分验证

第二节 欧前胡素及其代谢产物的大鼠排泄

第三节 异欧前胡素及其代谢产物的大鼠排泄

第四节 欧前胡素和异欧前胡素的大鼠组织分布

本章小结

第四章 欧前胡素和异欧前胡素的体外代谢性质研究

第一节 欧前胡素和异欧前胡素的肝微粒体代谢稳定性

第二节 欧前胡素和异欧前胡素的CYP酶代谢表型

本章小结

全文总结

参考文献

个人简历

硕士期间论文发表

硕士期间会议论文

硕士期间获得表彰奖励

致谢