狂犬病病毒强弱毒株感染潜伏期机体免疫应答的差异性研究

摘要

狂犬病是由狂犬病病毒引起的以脑脊髓炎为特征的急性人兽共患病，在世界范围内均有流行，全球每年约有60,000人死于狂犬病，其中多数发生在发展中国家。狂犬病病毒（RABV）宿主广泛，可感人、犬、猫、蝙蝠、狐狸等几乎所有的温血动物，神经组织嗜性是其感染的最典型特征，RABV侵入中枢神经系统（CNS）后，感染者几乎100％发病并最终导致死亡。
　　在动物种群中不断传播的狂犬病病毒野毒称为街毒（street virus），在形成致死性感染时，无论街毒最初感染发生在机体哪个部位，最终都将通过感染局部侵入外周神经然后逆轴突转运至中枢神经系统（CNS），发生严重的脑脊髓炎引发动物死亡。值得注意的是，RABV并非一进入机体就直接侵入神经系统，而是需要经历少则数天，多则数月乃至数年的潜伏期，或称隐蔽期，而后才能侵入神经形成不可逆的致死性感染。在CNS被强毒感染之前，带毒个体无可见的临床症状和明显的血清学反应。换言之，在狂犬病病毒的感染潜伏期，无法从临床表现和血清学反应判断该个体是否携带RABV。经人工驯化或人为变异产生的对动物致病力减弱或消除的RABV属于弱毒，弱毒株侵入机体，将在体内停留一段时间后于感染局部被清除，如果抵达CNS，将被瞬间消灭。RABV强弱毒株产生完全不同的感染结局，其毒力差别是造成这一结果的初始因素，而机体针对不同毒力RABV的应答差异则是决定感染结局的关键因素。阐明RABV进入机体后潜伏或―隐蔽的机制，对于狂犬病病毒早期感染分子标志的发现、干预感染、逆转感染以及暴露后早期诊断、发病后早期治疗研究都具有重要的理论和现实意义。
　　本论文以代表性狂犬病街毒和弱毒各1株为研究对象，其中街毒株BD06系本室2006年从保定一狂犬脑内分离得到，为中国I群（见附图-1），代表目前我国狂犬病流行的优势毒株；弱毒株SRV9，源自1935年从狗分离到的SAD株，经连续动物传代及细胞驯化后致弱，目前已开发为疫苗株在全球多地应用。本研究以上述狂犬病病毒街毒株及弱毒株分别感染小鼠，对感染后脑组织进行数字化基因表达差异分析（DGEs），Go富集及信号通路分析，研究街毒和弱毒株外周感染后免疫应答的差异及差异因子涉及的通路，并对潜伏感染中差异表达的基因进行克隆，以慢病毒为载体对差异基因参与RABV感染与复制的过程进行研究，具体如下：
　　1.数字化基因表达谱测序分析脑内感染两株RABV引起的免疫应答变化。分离到的狂犬病街毒株BD06驯化后，使其适应细胞培养，滴度能够稳定达到105.875TCID50/ml，可以满足后续的实验要求；将18只小鼠均分3组进行脑内感染：SRV9感染组、BD06感染组及对照组。在感染后的1dpi及6dpi进行颈部脱臼后，Rnase free条件下处理经RNA-seq测序，对数据分析可知，病毒感染1dpi，SRV9相对于BD06感染组，出现528个基因显著表达上调，对其进行聚类研究表明，大部分参与固有免疫应答信号通路，有些参与抗原呈递过程，而BD06与对照组相比，参与免疫应答基因基本没有变化；病毒感染6dpi时， BD06相比较于SRV9，441个基因表达明显上调，参与炎性应答的基因大幅提升，趋化因子表达提高，IFN表达量急剧增加，而适应性应答相关通路依然未被激活，细胞出现一种―稳态失调，小鼠体重下降明显，出现厌食、精神沉郁、四肢瘫痪等症状，而此时的SRV9较感染1dpi时，应答水平总体均有所增加，DC及B细胞活化较多，小鼠体重慢慢恢复增长，状态也逐渐恢复正常。
　　2.RABV Taq-Man荧光定量拷贝数方法的建立。为了研究两株RABV感染小鼠的病毒载量动态变化，更好地揭示病毒潜伏感染与病毒复制之间的内在关联，设计基于两株RABV定量的TaqMan探针引物，经筛选得到最优化的组合G2，为了消除引物与不同病毒N基因的结合差异，分别建立了针对两株病毒的定量标准曲线，灵敏度可达101拷贝数/μl、扩增效率接近100%，线性回归系数均在0.99以上，可以满足对BD06及SRV9株病毒载量的测定。
　　3.狂犬病病毒强弱毒株脑内及外周感染小鼠免疫应答差异的研究。因RNA-seq只选择了病毒感染的早期和晚期进行研究，对于病毒感染的中间时间段缺乏研究，为了揭示病毒感染潜伏期应答的全过程变化，将72只SPF级小鼠分成两大群，第一大群36只小鼠均分三组：SRV9感染组、BD06感染组及对照组，在病毒脑内感染后的1dpi、3dpi、5dpi及邻近死亡（ED）时眼球静脉丛采血、腹股沟淋巴结剥离、并在无Rnase环境下取脑组织进行RNA提取。另一大群小鼠均分三组在感染后每天进行体重称量。研究发现，SRV9感染组在1dpi时固有免疫应答即被激活进而参与抑制病毒的增殖，随着感染的进行，免疫应答逐渐增强，同时DC及B淋巴细胞被激活，在3dpi时诱导的病毒中和抗体（VNA）已接近0.5 IU/ml，一个被认为可达保护水平的数值，血脑屏障（BBB）通透性提高，免疫应答将病毒进行清除（病毒载量出现较明显的下降），当病毒载量下降后，固有免疫应答缓慢恢复正常，VNA对剩余RABV进行全部消除；而BD06感染组相比较对照组，在病毒潜伏的整个过程免疫应答基本上维持不变，病毒进入脑内维持一相对较低的―隐蔽状态，当病毒大量增殖时，诱导趋化因子及炎性应答强烈，IFN分泌激增，VNA仅在ED时有极少量分泌，此时，脑内未见明显的病理变化，小鼠消瘦，头部蜷缩，四肢麻痹，后肢瘫痪，机体衰竭而死亡。
　　外周感染时，SRV9组在病毒感染早期诱导机体产生少量VNA，感染中期VNA可达保护性水平，进而将病毒清除，使得病毒不能进入中枢神经（CNS），BD06感染时，感染早期逃逸机体免疫应答，一小部分病毒传运至脑部，潜伏一段时间后，进行大量增殖，引发趋化-炎性因子的―风暴应答，而产生的痕量VNA无法将病毒进行清除，机体发病。
　　4.IFITs抗 RABV感染与复制的研究。为了进一步探究IFITs(IFIT1、IFIT2、IFIT3、IFIT5)对于RABV感染潜伏期的影响，以 IFN诱导的293T细胞提取RNA进行扩增，克隆出IFITs，亚克隆到慢病毒表达载体pFUGW-H1中，基于二代慢病毒包装系统分别拯救出表达IFIT1、IFIT2、IFIT3、IFIT5的重组病毒，随后分别与RABV强弱毒株共感染细胞，对IFITs参与RABV感染与复制过程进行研究。
　　综上所述，我们比较了两种感染途径病毒感染潜伏过程中机体对于RABV强弱毒株的差异应答，研究发现，病毒一旦形成感染，SRV9能够被RIG-I及TLR信号通路识别，诱导固有免疫应答，从而对病毒复制进行干扰，随后激活的适应性免疫应答将病毒进行清除；而BD06感染时，病毒―隐蔽起来，逃逸模式识别受体（PRRs）的识别，少量病毒抵达中枢神经系统经潜伏一段时间后，病毒载量出现急剧增加，诱发CNS的―风暴应答，而此时机体产生的痕量VNA又不足以完全清除RABV，感染小鼠出现四肢瘫痪、嗜睡、共济失调等临床症状，但病理结果显示CNS细胞结构完好，机体衰竭死亡。细胞水平上，通过拯救出表达IFITs（IFIT1、IFIT2、IFIT3与IFIT5）的慢病毒分别与RABV共感染细胞，结果表明 IFIT3能够显著抑制RABV的复制，同时对于弱毒SRV9抑制效果比BD06效果更明显，而其他IFITs未检测到对RABV感染293T细胞有影响（不具有统计学差异），IFIT3抑制RABV强弱毒株效果的差异对于控制RABV街毒株感染提供一潜在的靶标。

目录

声明

缩略词表

第一章RNA-seq测序分析

引言

1.1材料和方法

1.2实验结果

1.3讨论

1.4小结

第二章RABV TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

2.1材料与方法

2.2结果

2. 3讨论

2.4小结

第三章狂犬病病毒强弱毒株感染免疫应答差异的研究

引言

3.1 材料和方法

3.2结果

3.3讨论

3.4小结

第四章 IFITs抗病毒机制研究

引言

4.1 材料和方法

4.2结果

4.3讨论

4.4小结

全文总结

参考文献

附录

在学期间发表的论著

个人简历

致谢