结直肠癌患者血清外泌体DNA与RNA中基因突变的研究

摘要

结直肠癌（colorectal cancer；CRC）是全球发病率第三位，致死率第四位的恶性肿瘤。它的发生、发展与环境、遗传等多种因素密切相关，是多基因、多步骤的累积过程。近年来，我国结直肠癌的发病率与死亡率也逐年上升，且发病年龄呈年轻化趋势。由于早期无明显的病理症状，大部分结直肠癌患者初诊时即为转移性结直肠癌（metastatic colorectal cancer;mCRC），即使部分患者接受了手术治疗，仍会出现术后的复发与转移，因此，化疗在结直肠癌，尤其是转移性结直肠癌的治疗中至关重要。FOLFOX和FOLFIRI作为目前化疗的一线治疗方案，能够有效缓解患者病情，但患者的中位生存期仍不到2年。靶向EGFR单克隆抗体-西妥昔单抗（Cetumimab）和帕尼单抗（Panitumumab）的出现，成为治疗结直肠癌的重大突破。
　　靶向EGFR单克隆抗体，通过与EGFR配体表皮生长因子（EGF）、转化生长因子α（TGF-α）等竞争性的结合EGFR的胞外区，阻止EGFR的激活，阻断EGFR下游信号通路，从而抑制肿瘤细胞的生长、侵袭、转移。然而，并非所有患者都能从EGFR单抗靶向治疗中受益，目前研究认为，靶向EGFR单克隆抗体疗效受到EGFR信号通路基因突变的影响，通过对KRAS、NRAS、BRAF、PIK3CA等基因的突变检查，可以筛查耐药的患者。因此，靶向治疗前与治疗中的基因突变检测十分重要。
　　基因突变检测，目前主要依赖组织学检查，标本来源于手术、结肠镜或穿刺活检，然而这些侵入性的检查，并不是所有患者都可以接受。并且，对已经进行了原发肿瘤根治性切除的结直肠癌患者而言，受转移灶的大小和位置等原因限制，获取转移灶的肿瘤组织在临床常常是较为困难的，会对患者造成一定的伤害，存在着较大的风险。此外，肿瘤异质性的存在，易造成检测结果的假阴性。因此，基于血液的非侵入性检查代替组织学检查将会是检测肿瘤基因突变的理想选择。
　　外泌体是一种30~150nm的双层膜囊泡，广泛分布存在于各种体液。作为一类重要的细胞间通讯分子，外泌体含有丰富的蛋白质、脂类以及多种核酸，且内含物与来源细胞具有一致性。在肿瘤中，由于肿瘤细胞与周围支持细胞间信号交流的需求量增加，外泌体的分泌量明显增加。因此，对肿瘤患者的血清外泌体内含物进行分析和检测，可辅助肿瘤的早期诊断、疗效评价和预后分析。本研究希望通过对结直肠癌患者血清外泌体中DNA、mRNA的检测与肿瘤组织检测结果对比，达到用外泌体DNA、mRNA检测替代肿瘤组织基因突变检测，以辅助早诊、临床用药指导以及评估。
　　本研究中，我们收集了90例临床确诊结直肠癌患者的全血标本，分别提取血细胞DNA、外泌体DNA以及外泌体mRNA。将3种核酸标本分别进行KRAS G12/G13、KRAS Q61，BRAF V600，NRAS Q61以及PIK3CA E542/E545、H1047相应片段的PCR扩增。通过对PCR产物进行高通量测序，检测90例结直肠癌患者血细胞DNA、血清外泌体DNA与mRNA中的突变情况，并与临床组织学检查结果相比较。
　　本研究结果显示，通过高通量测序，90例结直肠癌患者外泌体DNA和mRNA中均检出不同频率的8种类型的基因突变，分别为：KRAS基因中G12D、G12V、G12A、G12S和G13D，PIK3CA基因中E542K、E545K、H1047R。
　　外泌体DNA中共检出54例突变患者（突变率60.00％），其中KRAS基因突变51例（突变率为56.67%），PIK3CA基因突变42例（突变率为46.67%），KRAS基因合并PIK3CA基因突变的患者39例（突变率为43.33%）。KRAS基因中，检出G12D突变42例（突变率为46.67%），G12V突变1例（突变率为1.11%），G12A突变1例（突变率为1.11%），G12S突变1例（突变率为1.11%），G13D突变25例（突变率为27.78%）；PIK3CA基因中，检出E542K突变20例（突变率为22.22%），E545K患者10例（突变率为11.11%），H1047R突变27例（突变率为30%）。
　　外泌体mRNA中共检出49例突变患者（突变率为54.44%），其中KRAS基因突变40例（突变率为44.44%），PIK3CA基因突变39例（突变率为43.33%），KRAS基因合并PIK3CA基因突变的患者30例（突变率为33.33%）。KRAS基因中，检出G12D突变32例（突变率为35.56%），G12V突变1例（突变率为1.11%），G12A突变1例（突变率为1.11%），G12S突变1例（突变率为1.11%），G13D突变17例（突变率为18.89%）。PIK3CA基因中，检出E542K突变16例（突变率为17.78%），E545K突变检出9例（突变率为10%），H1047R突变检出24例（突变率为26.67%）。
　　本研究进一步对90例结直肠癌患者外泌体DNA与血细胞DNA进行相应基因突变频率的比较，结果显示血细胞DNA突变频率均小于1%，提示外泌体DNA中的突变来自于肿瘤细胞，可以反映肿瘤组织的突变。
　　为了进一步探讨外泌体中DNA与mRNA的突变是否与组织相关，本研究将外泌体DNA与mRNA的KRAS基因突变检测结果分别与组织DNA检测结果进行比较。结果显示，外泌体DNA中，KRAS G12突变检测灵敏度为90.63%，特异度为75.86%，与组织学检测一致性为81.11%；KRAS G13突变检测灵敏度为100%，特异度为82.28%，与组织学检测一致性为84.44%。外泌体mRNA中，KRAS G12突变检测灵敏度为68.75%，特异度为81.03%，与组织学检测一致性为76.67%；KRAS G13突变检测灵敏度为63.63%，特异度为87.34%，与组织学检测一致性为84.44%。提示外泌体DNA与mRNA的突变检测能够反应肿瘤组织DNA的突变情况，两种检测方法均显示出了较好的临床应用的潜在价值，尤其是外泌体DNA的突变检测，显示出了更好的敏感性与一致性。
　　在外泌体DNA与mRNA的比较研究中，mRNA中突变的患者均存在DNA突变，且二者突变类型一致，但mRNA中突变检出率为DNA的70.00%~85.00%。此外，各基因中DNA突变频率高于mRNA患者的数量均超过85.00%。以上两方面均说明外泌体mRNA中存在突变基因的低表达或不表达，通过对外泌体mRNA的突变检测可以了解突变基因在转录组中的影响。本研究进一步对KRAS G12、KRAS G13、PIK3CA E542、PIK3CA E545和PIK3CA H1047在外泌体DNA与mRNA的检测突变率进行比较，结果显示，各基因突变检测在外泌体mRNA与DNA比较均无统计学意义。
　　本研究还收集了20例使用西妥昔单抗治疗的结直肠癌患者的血清标本，对西妥昔治疗过程中外泌体DNA突变进行连续监测研究。结果显示，外泌体DNA的突变水平与西妥昔的疗效具有密切相关性，突变频率的增高能够早期预示西妥昔耐药，且预测能力优于目前临床肿瘤标志物。外泌体DNA突变水平的检测可以实现临床肿瘤实时微创监测，可能成为指导临床靶向EGFR单抗治疗的新方法。
　　综上所述，外泌体中DNA与RNA的突变检测可以反映肿瘤组织的突变状态，并且外泌体含量丰富、取材简便，可实现肿瘤突变的检测、监测，在临床应用中，具有巨大的潜在价值。

目录

声明

缩略语中英文对照

前言

第一部分 结直肠癌患者血清外泌体DNA突变的研究

1. 研究对象及标本收集

2. 实验材料、试剂耗材和主要仪器设备

3. 实验方法

4. 实验结果

5. 讨论

第二部分 结直肠癌患者血清外泌体RNA突变的研究

1. 实验材料、试剂耗材和仪器设备

2. 实验方法

3. 实验结果

4. 讨论

第三部分 结直肠癌患者西妥昔单抗治疗中外泌体DNA突变监测的研究

1. 标本收集

2. 实验材料、试剂耗材和主要仪器设备

3. 实验方法

4. 实验结果

5. 讨论

结论

参考文献

代表性论著:结直肠癌患者中血清外泌体代替肿瘤组织检测KRAS基因突变的研究

个人简历

致谢