中脑皮质边缘多巴胺系统对奖赏效应的精确调控与外源性大麻正性强化作用及机制研究

摘要

奖赏效应是机体趋利避害、保证个体生存和种族延续的重要机制之一。脑内的奖赏通路由中脑边缘皮质多巴胺系统构成。该通路始于中脑腹侧被盖区（VTA）的多巴胺（DA）能神经元，其神经纤维上行，经内侧前脑束投射至伏隔核（NAc）、海马（Hippo）、内侧前额叶皮层（mPFC）、杏仁核（Amg）等脑区，是目前公认的调节奖赏效应的公共通路。研究发现各类成瘾性物质均能直接或间接的激活上述奖赏中枢，诱导DA浓度升高，产生奖赏效应；在此基础上，进一步产生与药物奖赏作用相关的关联性学习记忆，进而诱导强迫性用药行为的出现，最终导致成瘾的形成。然而，成瘾性物质进入机体后，除会作用于奖赏中枢产生上述奖赏效应和成瘾外，还会同时作用于其他脑区，引起多种复杂神经递质的变化和复杂神经调控网络功能的改变。中脑边缘皮质DA系统在药物成瘾过程中扮演怎样的角色，对药物成瘾的产生有怎样直接的贡献尚没有足够的直接实验证据。采用传统的药理学、脑区损毁及电生理等实验技术，无法在空间和时间上特异精确解析特定神经元及单投射通路的作用。新兴的光遗传学技术能够克服这一瓶颈，可在动物清醒自由活动的状态下，研究瞬时激活或者抑制单神经元、单投射对于行为的调控作用。采用该技术，能够精确分析中脑边缘皮质DA系统在奖赏中所发挥的作用。这方面的精确解析不但对认识成瘾的神经生物学机制具有重要意义，还会为评价和研究药物成瘾性及药物对成瘾的影响与DA系统的关系建立更为灵敏的实验动物模型提供新的策略，为大麻等弱精神活性物质的奖赏效应评价和机制研究提供有效技术手段。
　　目前，大麻是在全球范围内滥用最为严重的精神活性物质。造成这一现状的根本原因是吸食大麻能给吸食者带来欣快感、幸福感和放松感等正性强化效应。大麻产生上述精神效应的主要成分是四氢大麻酚（Tetrahydrocannabinol,THC）。THC进入中枢神经系统后主要作用于大麻素受体1（Cannabinoid Receptor Type1,CB1R）。CB1R是与Gi偶联的G蛋白偶联受体（GPCR）。传统观点认为CB1R主要表达在γ-氨基丁酸（GABA）能抑制性神经元上。THC作为 CB1R的激动剂，当其与CB1R结合后，即可激活该受体，从而抑制了GABA能神经元的活性，解除GABA能神经元对DA能神经元的抑制，增强了后者的兴奋性，最终产生欣快效应。
　　虽然，大麻是当今世界上滥用最为广泛的精神活性物质，但在动物实验中大麻致成瘾潜能尚无定论。在评价成瘾的金标准模型—自身给药实验中，仅一家实验室，仅在非人灵长类动物（松鼠猴）成功建立了THC自身给药行为模型。在啮齿类动物条件性位置偏爱模型（Conditioned Place Preference，CPP）和颅内电刺激模型（(Intracranial self-stimulation，ICSS）上评价THC的成瘾潜能时，其研究结果相互矛盾。那么，究竟是何原因导致理论和实践如此大的不同呢？首先，大麻的致成瘾潜能较其他经典毒品（可卡因和海洛因）及合成毒品（甲基苯丙胺）相对较低；其次，对于大麻作用的主要靶点CB1R的研究而言，以往主要采用放射自显影，原位杂交或电生理的技术手段来确定其在脑内的表达分布，而以上技术手段由于操作繁杂，结果较大程度受限于信噪比的影响，无法精确实现不同细胞类型共定位，导致对于结果的解释存在一定的局限性和不完整性。例如，多数研究结果集中于报道CB1R表达水平较高的脑区，如海马，皮层等的GABA能神经元上，对于在奖赏作用中扮演重要作用的VTA脑区的CB1R表达情况鲜有涉及，而且对于其在与成瘾行为密切相关的其他神经元（DA能神经元）的表达也尚无明确结论。此外，THC作用于中枢神经系统后，可能诱发多种神经递质释放量的改变，目前的动物模型无法在时间和空间中精确分析该物质对单一的DA奖赏系统的影响作用。以上问题，导致了对大麻的正性强化作用及其神经生物学机制认识的局限性。阐明这些问题不但对人类准确认识大麻的成瘾潜能具有重要意义，还有利于我们对成瘾机制的全面认识。在欧美国家出现大麻合法化倾向的今天显得尤为重要。
　　基于以上问题，本文采用光遗传技术对中脑边缘皮质DA系统对奖赏效应的精确调节作用进行研究，成功建立了自给光模型；以此为基础，研究了大麻对奖赏系统的作用及可能的神经生物学机制。本研究的主要发现如下。
　　一、中脑边缘皮质多巴胺系统直接参与奖赏效应的调控
　　（一）特异性激活腹侧被盖区的多巴胺能神经元能够建立自给光行为
　　为了特异性的研究DA神经元的正性强化作用，本文采用了DAT-Cre转基因小鼠，将带有兴奋性光敏蛋白（ChR2）的腺相关病毒（AAV-DIO-ChR2-mCherry）微注射在VTA脑区，使得光敏蛋白特异性的表达在DA能神经元上，获得了DAT-CreChR2模型小鼠。在此动物模型上，波长为473nm的蓝色激光能特异性激活VTA脑区表达的腺相关病毒从而激活DA神经元。
　　1.病毒表达特异性与功能性确证
　　在本实验中，对进行立体定位注射病毒后的小鼠脑组织进行连续切片和免疫荧光染色，可观察到表达红色荧光的病毒神经元与DA神经元高度重合，提示该病毒在VTA脑区DA能神经元上能高特异性表达，能够满足实验要求。对于已表达病毒的脑片进行全细胞膜片钳记录，实验结果发现在用不同频率473nm的蓝色激光刺激下，神经元可发放与刺激频率相应的动作电位，证明此实验系统已被成功建立。
　　2.自给光刺激模型建立
　　2.1.刺激参数的选择
　　在本实验中，采用固定刺激时程（15 ms/pulse）和波长（473 nm），不同刺激频率（1、5、10、20、25及50 Hz，）诱导DAT-CreChR2小鼠建立自给光刺激模型（oICSS）及相应的频率效应曲线。结果表明，在上述刺激频率下DAT-CreChR2小鼠的有效鼻触次数随刺激频率增加而增加（n=9），呈现明显的频率依赖性；20 Hz以下的单个光脉冲刺激都能诱导稳定的动作电位发放（n=8）。此结果提示在特异性激活VTA的DA神经元后可使DAT-CreChR2小鼠产生相应的正性强化行为。根据上述实验结果，本文选择20 Hz为实验刺激频率，供后续实验研究使用。
　　2.2.颅内自给光训练
　　采用上述确定的刺激参数对VTA的DA能神经元进行刺激。对完成立体定位术后小鼠的VTA进行固定频率（20 Hz），每天60 min的自给光训练。结果发现，随训练次数的增加DAT-CreChR2小鼠有效鼻触次数（与光刺激偶联鼻触）迅速增加。与无效鼻触次数相比，从训练的第2天开始，有效鼻触次数显著升高（P<0.01，n=9），表现出正性强化效应。而对照组DAT-CremCherry无此反应出现（P>0.05，n=5）。以上结果提示利用光遗传学技术能高效且特异性强的操控DA神经元活动，具有时间和空间特异性；单纯激活VTA的DA神经元即可产生稳定的奖赏效应。同时建立的仅依赖DA系统的oICSS行为，可以用于评价药物对DA奖赏系统的影响。已知中脑边缘皮质DA系统是由始于VTA的DA神经纤维上行经内侧前脑束投射至NAc、Hippo、mPFC、Amg等脑区所构成，那么激活DA系统所产生的奖赏效应，具体是由哪个或哪几个投射通路所完成的呢？我们利用特异性刺激DA神经元投射末梢的方法对此进行研究。
　　（二）腹侧被盖区的多巴胺神经元不同投射通路在奖赏效应中的作用
　　1.免疫荧光和逆向追踪实验
　　我们首先在VTA单侧注射AAV-DIO-ChR2-mCherry病毒，然后对脑组织进行切片观察，发现在伏隔核核区（NAc core）、伏隔核外壳（NAc shell）、下边缘皮质（IL）和前边缘皮层（PL）均有红色荧光的神经纤维存在。接下来将逆向追踪染料Retrobeads分别定位注射于上述脑区，对VTA进行染色观察，发现VTA均有被标记的红色荧光表达，且与DA神经元的特异性染色标志物酪氨酸羟化酶（TH）重合，结果确证了从VTA发出的DA神经元投射到了上述脑区。
　　2.腹侧被盖区的多巴胺能神经元投射通路在奖赏中作用
　　将刺激光纤分别植入NAc core、NAc shell、IL和PL，进行光刺激，结果发现：1）与光刺激VTA相比，虽然在训练开始的前6天实验动物的有效鼻触增加速度均较慢，但与无效鼻触相比，NAc core组动物从训练第7天开始有效鼻触出现显著增加（P<0.05，n=9）；NAc shell组动物则从训练第12天开始与无效鼻触相比出现显著差异（P<0.05，n=7）；NAc core、NAc shell刺激的后3天有效鼻触次数分别为179±36.2次（n=9）和159±42.2次（n=7），均显著高于无效鼻触，但均显著少于刺激VTA时的有效鼻触723±112次（n=9）；2）刺激IL的DA能神经元末梢后，从第10天开始，有效鼻触显著高于无效鼻触（P<0.05，n=7），后三天平均有效鼻触次数为140±29.4次，显著高于无效鼻触28±10.3次（n=7）；刺激PL的DA能神经元末梢后，不能使实验动物出现显著自给光行为，最后三天有效鼻触次数为46±16.0，无效鼻触为35±12.4（n=7），无显著差异（P>0.05，n=5）。以上结果提示，从VTA发出的DA神经纤维在NAc core、NAc shell、IL的投射均参与到了奖赏过程，单独刺激上述通路即可引起奖赏行为，尽管效应较刺激VTA弱；在PL部位的投射与奖赏启动无直接关联。以往通过在体电生理记录以及测定DA浓度的方式认为NAc core只参与到了奖赏预期，只有shell才参与到奖赏正性刺激中，但我们的研究结果有力的证明刺激core和shell的DA能神经纤维均可直接产生奖赏作用。另外，以往认为mPFC的亚区主要参与决策与动机的调控，从我们的结果可看到IL也参与到了奖赏效应中。由此，我们将奖赏系统中的各条通路剥离开进行了研究，并初步阐明了它们在奖赏效应中的作用，对奖赏异常相关疾病提供了更为精确的靶区。
　　二、大麻正性强化作用及可能机制研究。
　　以上研究结果提示，中脑边缘皮质DA系统直接参与奖赏行为的调控。那么外源性大麻素的主要成分四氢大麻酚（THC）是否会影响该系统产生相应的药理学效应呢？THC是否具有奖赏作用呢？本研究分别从行为学和神经生物学两方面进行了相关研究。
　　（一）大麻受体1在腹侧被盖区的神经元分布
　　因为大麻受体1（CB1R）是THC在脑内发挥作用的主要靶点，因此了解CB1R的表达分布，特别是其神经元特异性分布的情况，则成为研究THC中枢作用的前提。通过免疫荧光技术和RNAscope技术，对CB1R在VTA的神经元特异性分布进行探究，结果发现：
　　1）用免疫荧光技术可以在VTA的神经纤维水平上检测到CB1R蛋白存在，但未能实现其与神经元类型之间的准确共定位；
　　2）用RNAscope实验技术则发现在VTA，CB1R的mRNA特异性地表达在DA能神经元、谷氨酸（Glu）能神经元及GABA能神经元的胞体上，提示CB1R可能在VTA的GABA能、Glu能和DA能神经元上均有表达。在特异性表达各类神经元的检测中，其表达比例分别为GABA：99.8±0.2％、Glu：99.4±0.4%，DA：26.8±4.3%。上述实验结果首次验证了在VTA脑区的GABA神经元和Glu神经元上有CB1R表达，并且首次发现在VTA的DA神经元上存在CB1R的mRNA表达。那么，DA能神经元上表达的CB1R是如何影响DA能神经元功能而实现THC作用的呢？于是，我们进一步采用已建立的仅激活DA奖赏系统的oICSS模型进行行为学和机制的深入研究。
　　（二）多巴胺能神经元参与外源性大麻正性强化作用及其可能神经生物学机制研究
　　1.多巴胺能神经元参与外源性大麻正性强化作用—行为学实验
　　在本实验中，应用DA能神经元CB1R条件性敲除小鼠DA-CB1-/-和非敲除小鼠DA-CB1+/+对THC激活DA能神经元上CB1R的作用开展了研究。由于THC无法在实验动物上建立自给药模型，所以我们利用本文第一部分创建的oICSS模型研究THC与DA系统的关系。
　　结果发现：
　　1）非敲除组与敲除组小鼠均腹腔分别给予可卡因（2 mg/kg、10 mg/kg）后，oICSS反应曲线呈剂量依赖性向左上方移动，曲线下面积（AUC）较给可卡因前均显著增大（n=6， P<0.01）。提示可卡因诱导DA释放增多后增强了光刺激的奖赏效应；提示oICSS频率效应曲线和经典的电刺激-ICSS曲线一样可用于评价药物的奖赏相应以及致依赖潜能；
　　2）非敲除组与敲除组小鼠均腹腔分别给予THC(1 mg/kg)后oICSS曲线均显著左移（非敲除组：n=8，P<0.01；敲除组：n=7，P<0.01）；在腹腔给THC3 mg/kg后非敲除组小鼠oICSS曲线右移，AUC显著降低（n=8，P<0.01），而敲除组小鼠无显著变化（n=7，P>0.05）；腹腔给予选择性CB1R激动剂ACEA3 mg/kg（n=8）后获得了同上实验结果。提示：
　　①低剂量THC对自给光行为可产生兴奋性作用（正性强化作用）。THC的此效应的神经生物学机制不是通过直接作用于DA能神经元发挥的，可能与其下调抑制性GABA能神经元功能相关；
　　②当剂量升高到3 mg/kg时，THC对自给光行为可产生抑制性作用，其机制可能是通过激活DA能神经元上CB1R下调DA能神经元功能实现的；
　　3）非敲除组与敲除组小鼠均腹腔分别给予大麻素受体2（CB2R）特异性激动剂JWH-133（10 mg/kg）后对oICSS曲线均无显著影响（n=4，P>0.05）。提示本实验模型中THC所发挥的作用与激活CB2R无关；
　　4）腹腔给药THC1、3、10 mg/kg后，3 mg/kg THC仅能使非敲除组小鼠自发活动显著降低（n=8， P<0.01），对敲除组小鼠自发活动无显著影响；10 mg/kg THC能使敲除和非敲除两组小鼠自发活动均显著降低（n=8，P<0.01）。提示3 mg/kg的THC对自发活动的降低作用可能是通过CB1R发挥的，高剂量10 mg/kg的THC对自发活动影响可能是大剂量THC对中枢神经系统的非特异抑制作用引起的；
　　5）在检测活动能力的转棒实验中，腹腔给THC3 mg/kg后，敲除和非敲除两组小鼠活动能力均未受影响（n=5，P>0.05）。提示3 mg/kgTHC减少实验动物自发活动可能是由于其降低基础DA水平，引起厌恶性效应，实验动物主观不愿意活动造成的。这些实验结果提示THC在低剂量（1 mg/kg，i.p.）下对实验动物有奖赏效应，该效应可能不是通过THC直接作用在DA能神经元上产生的，而是通过优势激活GABA能神经元上的CB1R，下调GABA能神经元功能，解除了后者对DA能神经元的抑制，间接上调DA能神经元功能引起的。中剂量（3 mg/kg）THC则呈现出致厌恶（抑制）效应，其机制很可能通过激活DA能神经元上的CB1R，抑制DA能神经元的兴奋性，而降低了DA神经递质的释放引起的。本实验通过对特异性敲除小鼠的研究，首次发现DA神经元上的CB1R直接参与了THC厌恶作用的调节。
　　2.可能神经生物学机制研究—神经化学实验
　　那么以上的推论确实存在与之对应的神经机制吗？在第一部分的研究中，我们已证实DA直接介导了奖赏效应，而NAc则是其发挥奖赏效应的主要靶脑区。为了进一步证明以上推论，我们采用清醒动物微透析技术进行研究，在相同的干预条件下，观察NAc内的DA浓度变化。
　　结果发现：
　　1）非敲除组小鼠DA-CB1+/+腹腔给药THC1 mg/kg后，NAc的DA含量无显著变化（n=7， P>0.05）；腹腔注射给予THC3 mg/kg后，NAc脑区的DA浓度显著降低。（n=6，P<0.01）；
　　2）条件性敲除小鼠DA-CB1-/-腹腔给药THC1 mg/kg后，NAc脑区的DA浓度显著升高（n=8，P<0.01）；腹腔注射给予THC3mg/kg后，NAc脑区DA浓度依旧显著升高（n=7，P<0.01），但升高幅度较1 mg/kg低，两者无显著差别；以上结果进一步提示，THC对机体的作用可能根据给药剂量的变化而呈现双相性的表现，即低剂量产生奖赏效应，而当剂量升高到一定程度后产生厌恶效应，这种效应是以NAc内DA浓度变化为基础的。又由于DA的变化在非敲除组与敲除组上呈现明显不同，此结果呼应了我们行为学研究的结论，更进一步说明了THC作用的剂量依赖性和DA神经元上CB1R对于厌恶作用的重要调节。
　　在以上研究中，我们首次证明了VTA脑区DA能神经元上存在CB1R，通过自身给光模型，发现小剂量THC发挥正性强化作用，剂量升高到一定程度则引起厌恶作用，为研究THC的中枢作用开辟了全新的研究领域。
　　（三）谷氨酸神经元参与四氢大麻酚作用及可能的神经生物学机制研究
　　在VTA脑区除存在DA能神经元外，还有Glu能神经元。前期的研究发现CB1R在Glu能神经元也有表达，而该神经元作为主要的兴奋性神经元，THC又会如何影响该类神经元，发挥了怎样的作用呢。本实验利用oICSS模型和Glu能神经元上特异性敲除CB1R的小鼠Vglut2-CB1-/-来研究THC作用与Glu能神经元之间的关系。
　　结果发现：
　　1）用如前所述光遗传学技术和研究方法特异性兴奋VTA的Glu能神经元也可使小鼠产生oICSS行为，但是整体踏板次数低于DA兴奋时的踏板次数，且给予D1R与D2R阻断剂后踏板次数均显著降低（n=4，P<0.01），提示激活Glu能神经元后兴奋了DA能神经元产生奖赏效应；
　　2）非敲除组(Vglut2-CB1+/+)与敲除组(Vglut2-CB1-/-)小鼠均腹腔分别给予可卡因（2 mg/kg、10 mg/kg）后， oICSS反应曲线剂量依赖性地向左上方移动，在10 mg/kg剂量下曲线下面积均显著增加（n=6，P<0.01），曲线阈值与M50均显著降低（n=6，P<0.05），提示可卡因诱导DA增多后能够增强奖赏效应；
　　3）非敲除组与敲除组小鼠腹腔给予THC1 mg/kg后oICSS曲线均出现左移趋势，但无显著性差异（n=6，P>0.05）；在腹腔给予THC3 mg/kg后非敲除组小鼠oICSS曲线显著右移，曲线下面积显著减小（n=6，P<0.01），曲线阈值与M50值显著升高（n=6，P<0.001）；而敲除组小鼠则无上述变化（n=6， P>0.05）。提示两组小鼠对低剂量的THC反应一致，但中剂量对非敲除组产生了抑制效应。此抑制效应的产生机制可能与大剂量THC激活了Glu神经元上的CB1R、下调Glu能神经元功能、最终引起DA能神经元功能下调相关；
　　4）腹腔给药THC1、3、10 mg/kg后，在3 mg/kg与10 mg/kg剂量下仅非敲除组小鼠自发活动显著减少（n=8，P<0.01），而对敲除组小鼠无影响（n=8，P>0.05）。提示Glu神经元上的CB1R参与调节了自发活动；
　　5）腹腔给予THC3 mg/kg后，伴随光刺激时，依旧可以升高已降低的自发活动（n=7，P<0.05）提示该剂量的THC并没有改变小鼠对于光刺激反应性。上述实验结果提示Glu能经元的兴奋通过上调DA神经元功能、增加DA的释放介导奖赏效应。外源性大麻（THC）通过激活Glu能神经元上的CB1R、下调DA能神经元功能，间接调节了中剂量THC产生的厌恶作用。
　　综上所述，本课题证明中脑边缘皮质DA系统在奖赏中发挥了重要作用；首次发现了由VTA发源的DA能神经纤维投射在NAccore、NAc shell、IL和PL等脑区在奖赏行为正性强化作用中分别扮演的角色；成功建立了oICSS模型。首次发现DA能经元上存在CB1R表达。在这一发现基础上，利用此模型研究发现外源性大麻通过激活位于DA能和Glu能神经元上的CB1R，改变这些神经元功能，实现其自身的低剂量奖赏效应和中高剂量的厌恶效应。本课题的研究为阐明DA系统在奖赏中的作用提供了理论依据，为外源性大麻作用的神经生物学机制提供了新线索。

目录

声明

缩略词表

前言

1. 中脑边缘皮质多巴胺系统与奖赏

2. 外源性大麻的作用及其和多巴胺系统的联系

第一章 基于光遗传学技术研究中脑边缘皮质多巴胺系统对奖赏行为的调节

研究背景

第一节利用光遗传学建立多巴胺能神经元特异性自给光行为

1. 材料和方法

2. 结果

3. 讨论

4. 小结

第二节 腹侧被盖区的多巴胺能神经投射通路在奖赏效应中的贡献

1. 材料与方法

2. 结果

3. 讨论

4. 小结

第二章 四氢大麻酚的正性强化作用及可能机制研究

研究背景

第一节 大麻素受体1在腹侧被盖区的神经元表达分布

1. 材料和方法

2. 结果

3. 讨论

4. 小结

第二节 四氢大麻酚作用于多巴胺神经元上的大麻素受体1对其正性强化作用的调节及可能机制

1. 材料与方法

2. 结果

3. 讨论

4. 小结

第三节 四氢大麻酚作用于谷氨酸能神经元上的大麻素受体1对其正性强化作用的调节及可能机制研究

1. 材料与方法

2. 结果

3. 讨论

4. 小结

第三章 结论

参考文献

在读期间发表的代表性论著

个人简历

致谢