LncRNA-miRNA-mRNA相互作用初步研究

摘要

人类的整个基因组中至少有85％左右的 DNA能转录并合成 RNA，但这些RNA中又只有不足2%的RNA可以翻译成为蛋白质，而余下部分皆不编码蛋白质，这些RNA就被称作“非编码RNA”。随着相关研究的深入进展，人们发现非编码RNA分子能够在不同的水平，通过多种途径调节基因的表达，从而参与细胞、组织乃至整个机体的各项生命过程，从而改变了“一切生命活动以蛋白质为基础”的观念。非编码RNA依照其长度的不同可分为短链非编码RNA、中等长度非编码RNA以及长链非编码RNA（Long no-coding RNA, LncRNA）。短链非编码RNA长度小于50 nt，中等长度非编码RNA长度介于50-200 nt，而长非编码RNA长度大于200 nt。而且近年来研究表明，不同长度的RNA之间存在相互作用，特别是LncRNA与miRNA、miRNA与mRNA、lncRNA与mRNA都存在相互调节的关系，形成了lncRNA-miRNA-mRNA的相互调控网络，理清这一复杂而精细的调控网络，对于揭示RNA分子间的相互作用及阐释其功能至关重要。
　　第一部分：miRNA加速“分子海绵”lncRNA降解
　　LncRNA指的是一类长度大于200个核苷酸，不编码蛋白质的长链RNA分子。现已发现长非编码RNA在哺乳动物细胞中广泛表达，成千上万的长非编码RNA相继被鉴定出来，但是人们对它们的分子机制以及功能研究还处在起步阶段，目前为止，功能已知的非编码RNA也只有100多种。长非编码RNA相比较于编码蛋白的基因表达水平表达一般要低，保守性也比较差，不形成较大的同源家族。一般认为长非编码RNA按来源可分为如下几类：从基因间区转录，从基因的上游区域转录以及基因的反式转录产物；从长非编码RNA的功能上可以将其归为四类分子：指导分子、诱饵分子、信号分子和骨架分子。长非编码RNA能够对细胞的多个生物学活动进行调控，包括转录前的表观遗传学调控、基因转录水平调控、基因的转录后调控、细胞的亚结构的构成及染色体重塑的调控、细胞分化和机体的发育等。此外，研究发现长非编码RNA的异常表达与许多重大的人类有联系，主要包括癌症、神经系统疾病、糖尿病和自身免疫病等。
　　随着研究的深入，lncRNA被发现能够成为miRNA的“分子海绵”，即lncRNA通过与miRNA结合，减弱miRNA对靶基因的“沉默效应”，从而对miRNA的靶基因进行调控。因此，lncRNA与 miRNA的相互作用关系逐渐成为了一个研究热点。
　　针对lncRNA与miRNA之间的相互作用，结合已有研究报道我们提出了三个科学问题：大部分miRNA的稳定性比较强，半衰期比较长，那么吸收miRNA的“分子海绵”lncRNA稳定性如何；lncRNA与靶mRNA竞争结合miRNA，它们之间的相对丰度是否决定了竞争作用的结果；此外，lncRNA“分子海绵”的作用是否具有普遍性。
　　围绕这三个提问，我们从lncRNA“分子海绵”功能入手，选取了五个具有“分子海绵”的长非编码RNA，这些lncRNA都可以通过竞争结合miRNA，调控miRNA靶mRNA。我们选择了HEK293T和HeLa细胞作为细胞模型，对细胞内几种lncRNA和mRNA的半衰期进行检测。我们使用放线菌素D对细胞内转录进行了抑制，然后收集五个时间点（0、4、8、12、24h）的细胞总RNA，qRT-PCR检测各个时间点lncRNA和靶mRNA的表达量，结果显示，具有“分子海绵”作用的lncRNA半衰期并不都很长，除lncRNA-UCA1半衰期较长大于24 h，其它lncRNAs半衰期均小于12 h；随后我们检测了lncRNA与mRNA的相对丰度，lncRNA与mRNA的相对丰度有高有低，也并非有分子海绵功能的lncRNA其丰度相对于靶mRNA就高；过表达miRNA，检测lncRNA半衰期，我们发现过表达miRNA使lncRNA的半衰期大大减短，促进lncRNA的降解；随后，我们构建了lncRNA-UCA1的过表达载体，我们发现miR-216b能够加速细胞内源或者外源过表达的lncRNA-UCA1的降解，而且通过使用miR-216b的抑制剂能够抑制miR-216b加速降解lncRNA-UCA1的作用。
　　上述结果提示，lncRNA作为miRNA的“分子海绵”的作用是通过lncRNA以碱基互补配对方式与miRNA的靶 mRNA竞争 miRNA，降低了游离 miRNA的含量，从而实现对靶mRNA的调控，同时lncRNA结合miRNA之后，其也作为miRNA一个靶基因，miRNA降低lncRNA的稳定性，促进其降解。
　　第二部分：lncRNA抑制miRNA对非完全匹配靶mRNA的降解
　　miRNA（microRNA）指的是一类长度大约18-22 nt的单链非编码RNA分子， miRNA具有高度保守性、组织的特异性以及时空特异性。miRNA在转录后水平调控基因表达，其通过碱基互补与靶 mRNA的3’端非翻译区域（3’translated region,3’UTR）结合，导致靶mRNA剪切或者翻译抑制，从而调控靶基因的表达。现在认为，miRNA主要通过两种方式对靶基因进行“沉默”，一种是miRNA与靶mRNA3’UTR区结合位点完全匹配，引起Ago2(Argonaute2)蛋白介导的靶mRNA剪切，从而引起 mRNA分子的快速降解；而另一种指的是，miRNA与mRNA的3’UTR区域形成不完全的碱基降解，这时引起靶mRNA的翻译抑制，以实现靶基因的调控。miRNA已被发现参与生物体的多项生命活动，其在细胞内基因表达，细胞分裂增殖，细胞分化，细胞凋亡乃至生物体的发育都起到相当重要的作用，而且miRNA的异常表达与多种疾病也有较为紧密的联系。
　　LncRNA-GAS5作为miR-21的细胞内天然“分子海绵”，能够通过与miR-21结合从而吸收miR-21，抑制miR-21对靶基因的作用。PTEN和TPM1是miR-21的非完全匹配靶基因。我们首先在HEK293T细胞和HeLa细胞验证mi-21能够通过与PTEN和TPM1非完全互补调控PTEN和TPM1蛋白的表达，但并不影响PTEN和TPM1的mRNA的表达量；此外，过表达miR-21后，qRT-PCR检测PTEN和TPM1 mRNA的半衰期，发现它们的半衰期显著缩短，miR-21加速PTEN和TPM1 mRNA的降解。通过转染lncRNA-GAS5的过表达质粒，我们发现lncRNA-GAS5竞争性的与miR-21结合能够延长PTEN和TPM1 mRNA的半衰期。
　　上述结果提示我们，lncRNA-GAS5作为 miR-21的“分子海绵”能够抑制miRNA对其非完全匹配靶mRNA PTEN和TPM1的降解。LncRNA与mRNA存在这样的相互作用，能够帮助我们理解并完善lncRNA-miRNA-mRNA调控网络。
　　第三部分：相关表达载体的构建及表达验证
　　为了探究 mRNA是否能够调控 lncRNA的稳定性和丰度，我们需要构建靶mRNA的3’UTR区表达载体。miR-21靶基因TPM13’UTR区真核过表达载体的构建，miR-216b靶基因FGFR13’UTR区真核过表达载体的构建，以及上述载体的表达验证；miR-21靶基因PTEN和TPM13’UTR荧光素酶载体的构建。结果显示，这些过表达载体以及荧光素酶载体的构建成功，为后一步更加深入的研究lncRNA-miRNA-mRNA相互作用关系，提供了强有力的工具。

目录

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缩略词表

第一部分 miRNA加速“分子海绵”lncRNA降解

前言

1.1实验材料

1.2 实验方法

1.3 实验结果

1.4 讨论

第二部分 LncRNA抑制miRNA对非完全匹配靶mRNA的降解

前言

2.1实验材料

2.2 实验方法

2.3 实验结果

2.4 讨论

第三部分 相关表达载体的构建及表达验证

前言

3.1实验材料

3.2 实验方法

3.3 实验结果

3.4 讨论

结论

参考文献

致谢

附录Ⅰ：个人简历

附录Ⅱ：攻读学位期间发表的学术论文