马铃薯S病毒外壳蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备

摘要

本研究的目的是构建马铃薯S病毒(PVS)外壳蛋白(CP)基因的原核表达载体，实现其高效表达，用表达产物作抗原制备抗血清，进一步获得纯化的抗体(IgG)与酶标记抗体并用于PVS的DAS-ELISA检测，为组装PVS的ELISA检测试剂盒奠定基础。 以质粒pGEM-pvs为模板，经PCR扩增获到了长约890bp的PVS～CP基因条带。用Ultrafree-DA试剂盒一步离心法回收特异性DNA片段并与T表达载体pBAD/Thio-TOPO连接，连接物转化受体菌TOPO10获得了Amp抗性菌落。经质粒电泳检测、PstⅠ与SphⅠ的单酶切和双酶切鉴定，筛选到了PVS-CP基因正向插入载体的阳性克隆，相应的重组质粒命名为pBAD-SCP。DNA测序结果表明882bp的不含终止密码的PVS-CP基因序列插入载体的方向正确、密码子的阅读正确，即成功构建了PVS-CP基因的原核表达载体。 用阿拉伯糖诱导工程菌TOPO10(pBAD-SCP)中外源基因的表达，获得了预期的49kDa融合蛋白。诱导研究表明在SOB培养基中融合蛋白的表达量高于LB培养基，经优化的表达条件为：37℃，在SOB培养基中用0.2％阿拉伯糖诱导4h。光密度扫描结果表明该融合蛋白在细菌总蛋白中占的比例为27％。 用溶菌酶裂解菌体，提取细菌总蛋白，SDS-PAGE显示表达的融合蛋白主要以包涵体的形式存在。用8M尿素溶解包涵体，经镍离子亲和层析纯化，获得了高纯度的目的蛋白。对纯化后的变性蛋白进行了透析复性与柱上复性处理，获得了两种复性蛋白。 分别用纯化得到的变性蛋白、透析复性获得的蛋白与柱上复性获得的蛋白作抗原免疫家兔，制备出了抗血清。琼脂糖双向扩散显示三种抗血清与抗原(融合蛋白)均能形成明显的沉淀线，即获得了该蛋白的特异性抗血清，用变性蛋白制备的抗血清的效价为1：16，其余两种为1：32。间接ElISA测定表明复性蛋白抗血清的效价分别为1：12800和1：6400，而变性蛋白抗血清的效价为1：1600。两种测定方法的结果都表明复性蛋白抗血清的效价高于变性蛋白的抗血清。 先用饱和(NH<,4>)<,2>SO<,4>进行盐析，然后用Protein G亲和层析柱纯化，获得了高纯度抗体(IgG)。用戊二醛一步法对纯化的抗体进行标记，获得了IgG的碱性磷酸酶标记物。用纯化的IgG与酶标抗体(IgG-AP)对感染PVS的幼苗进行DAS-ELISA检测，结果呈阳性，健康的幼苗则呈阴性，结果表明获得了PVS的特异性多克隆抗体与酶标记抗体。 本研究为通过基因工程途径大量制备PVS抗体、酶标抗体及组装DAS-ELISA试剂盒奠定了基础。

目录

论文说明：缩略语表

声明

摘要

文献综述

1马铃薯病毒病

1.1马铃薯X病毒(Potato virus X,PVX)

1.2马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)

1.3马铃薯卷叶病毒(Potato leafroll,virus,PLRV)

1.4马铃薯S病毒(Potato virus S,PVS)

2马铃薯脱毒与病毒检测方法

2.1马铃薯脱毒技术

2.2马铃薯病毒的检测

3病毒抗血清的制备

3.1以病毒粒体为抗原

3.2以病毒CP基因原核表达产物为抗原

4本研究的目的和意义

材料和方法

1材料

1.1菌种、质粒及载体

1.2酶与试剂盒

1.3主要试剂

2方法

2.1引物设计与合成

2.2重组质粒pGEM-PVS转化DH5α

2.3 PVS-CP基因的PCR扩增

2.4 PCR产物的回收(Ultrafree-DA法)

2.5 PVS-CP基因原核表达载体的构建

2.6 PVS-CP基因在大肠杆菌中的表达

2.7细菌总蛋白的提取与目的蛋白的纯化

2.8目的蛋白的复性

2.9复性蛋白的透析浓缩与定量

2.10抗血清的制备

2.11抗血清效价的测定

2.12抗体(IgG)的纯化

2.13抗体的酶标记

2.14 PVS的DAS-EIISA检测

结果与分析

1 PVS-CP基因原核表达载体的构建

2 PVS-CP基因的原核表达

3细菌总蛋白的提取与目的蛋白的纯化、复性

4抗血清的制备

5 IgG的分离、纯化与标记

6 PVS的DAS-ELISA法检测

讨论

结论

参考文献

附录：溶液配制

致谢