魔芋甘露聚糖肽中氨基酸指纹图谱研究

摘要

甘露聚糖肽是一类我国首创的生物反应修饰物，具有提高机体免疫力、抗贫血、抗肿瘤等作用。目前市售甘露聚糖肽系从正常人咽喉部分离的α-溶血性链球菌33＃菌株经深层发酵培养、提取制得的一种多糖肽类物质。甘露聚糖肽经水解后可产生游离的氨基酸，因此可通过检测氨基酸指纹图谱来反映其质量。另一方面，魔芋飞粉为魔芋精粉加工过程中的副产物，质量轻、颗粒小，大约占魔芋粉质量的38％。现代研究发现魔芋飞粉中含有丰富的糖类、蛋白质、矿物质、纤维素等多种类型的化合物，具有很高的开发利用价值，可作为生产甘露聚糖肽的良好来源。
　　本研究采用高效液相色谱法建立了魔芋甘露聚糖肽氨基酸的指纹图谱，以便为魔芋飞粉的深度开发利用及甘露聚糖肽的生产与质量控制提供参考。实验结果如下：
　　以陕西不同产地共10批魔芋飞粉为原料，制备甘露聚糖肽。首先采用酶解法将魔芋糖蛋白酶解为魔芋糖肽，再用Sevage试剂法对糖肽粗提液进行脱杂肽处理，最后用DEAE-52纤维素和葡聚糖凝胶G-100柱层析分离。结果表明，以酪蛋白磷酸肽为标准品绘制的标准曲线线性回归方程为y=0.992x﹢0.00233，R2=0.9995，线性关系良好。10批魔芋糖肽脱杂肽后，经计算多肽得率范围为13.96%~14.71%。最后收集经DEAE-52纤维素柱层析后位于第29-42管之间的洗脱液，以及经SephadexG-100柱层析后第7-12管之间和第22-34管之间的洗脱液，即可分离得到魔芋甘露聚糖肽。
　　针对10批魔芋甘露聚糖肽建立了氨基酸指纹图谱。采用柱前衍生高效液相色谱法，以异硫氰酸苯酯（PITC）作为衍生试剂，流动相:（A）乙腈-水（60∶40）、（B）0.1mol/L醋酸钠-乙腈（93∶7，用乙酸调pH至5.9），色谱柱为Diamonsil C18色谱柱（250mm×4.6mm，5μm）；柱温30℃；流速1.0 mL/min；检测波长254nm；进样量20μL；检测时间40min；按梯度洗脱。结果表明，同一供试品共有峰保留时间和峰面积均无明显变化，RSD均小于3%，说明试验仪器精密度良好，方法重现性良好，供试品溶液在24h内呈现出良好的稳定性。采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统进行分析，相似度均在0.9以上，表明10批魔芋甘露聚糖肽指纹图谱有良好的相似性。共检测出12个共有特征峰，分别为丝氨酸、甘氨酸、精氨酸、丙氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸。
　　为了与魔芋甘露聚糖肽的质量进行比较，本文参照《中药注射剂指纹图谱的技术要求（暂行）》的标准，对甘露聚糖肽注射液中氨基酸的 HPLC指纹图谱进行了研究。建立了来自2个厂家共10批次甘露聚糖肽注射液氨基酸指纹图谱，标定了甘露聚糖肽注射液氨基酸指纹图谱的12个共有峰，与魔芋甘露聚糖肽氨基酸指纹图谱测定结果一致。经计算10批甘露聚糖肽注射液指纹图谱的相似度在0.935~0.999之间，结果符合国家中药指纹图谱的建立要求，注射液样品质量基本稳定。

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1 绪论

1.1 甘露聚糖肽概述

1.2魔芋飞粉研究与应用现状

1.3氨基酸分析方法研究概况

1.4 指纹图谱技术的研究与应用

1.5课题研究的意义与内容

2 魔芋甘露聚糖肽的制备

2.1 材料与方法

2.2 结果与讨论

2.3 小结

3 魔芋甘露聚糖肽指纹图谱研究

3.1 材料与方法

3.2 结果与讨论

3.3 小结

4 甘露聚糖肽注射液指纹图谱的研究

4.1 材料与方法

4.2 结果与讨论

4.3 小结

5 结论与展望

5.1 结论

5.2 展望

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文

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