基于代谢组学研究蜂胶和葡萄籽有效成分对糖尿病的作用机制

摘要

糖尿病（DM）是由于胰岛素缺乏或功能缺失引起的多功能慢性代谢紊乱疾病，主要症状以高血糖为特征，会引发多种严重的并发症，已经成为严重威胁人类的健康疾病之一。
　　代谢组学是一门全面、系统研究生物体受到遗传修饰和外界刺激下随时间变化规律产生的所有代谢物变化应答的新兴学科。作为崭新的方法学，代谢组学具有高通量、高灵敏度及强特异性等优势，通过研究疾病以及服药后机体内源性代谢物的变化，来全面探索机体代谢途径，进而阐述疾病的发病机理和药物的作用机制，从而为DM的诊断开辟了新的途径。
　　本研究拟采用高脂高糖喂养联合链脲佐菌素(STZ)诱导，构建糖尿病大鼠模型，蜂胶有效成分咖啡酸苯乙酯（CAPE）及葡萄籽有效成分原花青素（PC）作为保护药物，通过生理生化指标及组织形态学进行模型验证。利用代谢组学分析技术超高效液相-飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF/MS），对正常对照组、糖尿病模型组及不同药物保护组的血清进行了代谢物谱的分析，采用多元统计分析及模式识别寻找出诱发糖尿病的潜在生物标记物。同时，探讨了糖尿病大鼠的发病机制及保护药物的保护机制，为糖尿病的临床诊断及药物的开发提供数据支持和理论依据。
　　（1）DM大鼠模型的建立及模型验证
　　SD雄性大鼠喂养高脂高糖饲料六周后，小剂量（30mg/kg）注射STZ诱导糖尿病大鼠模型。经生理生化指标及各主要脏器形态学分析模型构建成功。生理指标结果表明符合糖尿病“三多一少”的典型特征，生化指标结果检测表明血清甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)及低密度脂蛋白(LDL-C)较对照组相比，糖尿病模型组显著升高（P<0.01,P<0.001,P<0.001），高密度脂蛋白(HDL-C)较对照组，DM模型组明显下降（P<0.001），说明高脂高糖饲料联合STZ构建糖尿病大鼠造成了损伤，给予CAPE及PC保护后，其损伤得到了明显的改善，说明CAPE及PC对糖尿病具有一定的保护作用。
　　（2）糖尿病模型大鼠给药前后血清代谢物谱的UPLC-Q-TOF/MS分析
　　采用UPLC-Q-TOF/MS对对照组、DM模型组及CAPE和PC保护组血清进行检测，通过主成分分析法对对照组、DM模型组及保护组血清代谢物谱进行分类并寻找与DM发生有关的生物标记物。结果表示，各组大鼠血清样品实现完全分离，同时DM模型组大鼠不对称二甲基精氨酸、精胺、LPA（18:1）、PI（18:1/16:0）和LysoPC(18:2))较对照组明显增加，在给予CAPE及PC干预后，结果显示体内上述代谢物的含量有所下降。不对称二甲基精氨酸及磷脂类代谢物的变化均有可能与氧化应激有关，同时溶血性磷脂变化也与元素、生化指标的改变有关，而给予保护药保护后代谢物发生了相应的变化，体现了CAPE与PC对糖尿病均具有保护作用。
　　（3）糖尿病大鼠发病机理的研究
　　对各组大鼠组织氧化指标(蛋白羰基化(PCO)、丙二醛(MDA))、炎症因子(一氧化氮(NO))及抗氧化体系(超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)、过氧化氢酶(CAT))进行检测，结果表示DM模型组各组织氧化指标MDA、NO、PCO含量显著高于对照组(P<0.05)，抗氧化酶SOD、GSH、CAT活性明显低于对照组(P<0.05)，给予CAPE和PC治疗后氧化指标的上升得到抑制，抗氧化酶活性出现上升。说明糖尿病能够增加各脏器的氧化应激，诱导氧化损伤，而保护药能够减少氧化损伤，起到保护作用。同时对其各组织、血清、尿液中的元素进行含量检测，结果显示DM模型组各组织与血清中Zn2+、Mg2+、Ca2+、Fe2+的含量显著减少，Cu2+的含量显著增加，经CAPE与PC保护后大鼠体内Zn2+、Mg2+、Ca2+、Fe2+元素的含量相对的上升，Cu2+含量相对下降；同时糖尿病组大鼠尿液中Zn2+、Cu2+、Mg2+、Ca2+、Fe2+的含量显著增加，经保护药保护后的大鼠尿液元素的含量有相对的下降。结果显示糖尿病的发生，一方面可能与其体内损伤ROS有关，另一方面与其体内元素变化有关。CAPE及PC对糖尿病的保护作用一方面与结构特征有关，另一方面可作为多种信号通路的激动剂，因此本实验为进一步阐明糖尿病的作用机制以及临床开发新物提供科学依据。

目录

1 绪论

1.1 糖尿病的概述

1.1.1 糖尿病的定义

1.1.2 糖尿病的分类及发病原因

1.1.3 糖尿病的发病机理

1.1.4 糖尿病的症状

1.1.5 糖尿病的特点

1.2 代谢组学的概述

1.2.2 代谢组学与其他组学的关系

1.2.3 代谢组学研究方法

1.2.4 代谢组学在药学中的应用

1.2.5 代谢组学方法在糖尿病研究中意义

1.3 咖啡酸苯乙酯的介绍

1.4 原花青素的介绍

1.5 本论文立题目的及方案

2 糖尿病实验动物模型的建立及验证

2.1 实验材料

2.2 实验方法

2.3 模型建立

2.4 模型验证

2.4.1 各组大鼠生活状况观察

2.4.2 各组大鼠血糖及糖耐量(OGTT)实验

2.4.3 生理指标变化及脏器系数

2.4.4 血清中生化指标的检测

2.4.5 组织形态学观察

2.5 结果与讨论

2.6 本章小结

3 糖尿病模型大鼠给药前后血清代谢物谱的分析

3.1 糖尿病模型大鼠给药前血清代谢物谱的分析

3.1.1 实验材料

3.1.2 实验方法

3.1.3 糖尿病模型大鼠给药前血清代谢物谱结果与讨论

3.2 糖尿病模型大鼠给药后血清代谢物谱的分析

3.2.1 实验材料

3.2.3 实验方法

3.2.4 糖尿病大鼠给予咖啡酸苯乙酯血清代谢物结果与讨论

3.2.4糖尿病模型大鼠给予原花青素血清代谢物结果与讨论

3.3 本章小结

4 糖尿病大鼠发病机理及保护药物机理的研究

4.1 实验材料

4.2 实验方法

4.2.1 氧化和抗氧化指标及炎症因子的检测

4.2.2 元素分析

4.3 结果与讨论

4.4 本章小结

5 总结

5.1 结论

5.2 创新点

5.3 展望

致谢

参考文献

附 录A

附 录B

攻读硕士学位期间发表的学术论文及出版的著作目录

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