乌骨鸡黑色素皮质激素受体-1基因(MC1R)的克隆表达

摘要

乌骨鸡是中国特有的品种，主要特点为乌骨、乌皮、乌肉，具有极高的营养价值。研究表明，乌骨鸡的营养价值主要体现在其体内的黑色素。因此，本研究旨在克隆乌骨鸡黑色素主效基因:黑色素皮质激素受体-1(melanocortin1-receptor,MC1 R)，并转染哺乳动物成纤维细胞，以期获得稳定表达的细胞系，为转基因动物的制备打下基础。
　　 本试验提取乌骨鸡肌肉RNA，并反转录成cDNA，根据GeneBank发表的原鸡MC1R序列设计引物，使用PCR方法扩增乌骨鸡MC1R基因序列，并连接至pMD-18T载体上，测序后，经限制性内切酶EcoRⅠ和SalⅠ双酶切回收，并与同样经EcoRⅠ和SalⅠ双酶切的pET-32a相连，转化至Ecoli DH5α中。待酶切鉴定与测序正确后，转化至EcoliBL21(DE3)中，经氨苄青霉素筛选，IPTG诱导表达。经SDS-PAGE检测，表达产物相对分子量约57KD。利用Ni2+能与融合蛋白上的多聚组氨酸结合的特点，进行Ni2+亲和层析纯化，纯化得到的蛋白使用SDS-PAGE检测纯化效果。纯化得到的蛋白与弗氏佐剂乳化后，皮下注射免疫家兔，经四次免疫后，收集其抗血清，制备兔抗鸡MC1R多克隆抗体，经琼脂糖扩散实验检测证明，抗血清效价较高，可做western blot检测用。
　　 同时，本试验还将含有EcoRⅠ和SalⅠ双酶切位点的MC1R序列片段与同样经EcoRⅠ和SalⅠ双酶切的真核表达载体pEGFP-N1相连，构建真核表达载体pEGFP-N1-MC1R。经酶切鉴定与测序正确后，通过电穿孔的方法转染至山羊成纤维细胞中。经20μg/ml G418筛选出阳性克隆。然后通过RT-PCR鉴定重组质粒pEGFP-N1-MC1R已经整合至山羊成纤维细胞基因组中并已开始表达。最后利用实验一制备的兔抗鸡MC1R抗血清进行western blot检测，结果显示:乌骨鸡MC1R基因在山羊成纤维细胞中稳定表达，获得了稳定表达乌骨鸡MC1R基因的稳定表达的细胞系。

目录

摘要

英文缩写词表

前言

文献综述

乌骨鸡黑色素研究进展

1、禽类黑色素的分类、形成、结构

2、乌骨鸡黑色素的功能

3、乌骨鸡黑色素在体内的沉积顺序

4、乌骨鸡黑色素相关基因

转基因动物研究进展

1、转基因动物的制备方法

2、转基因动物的应用

试验一 乌骨鸡黑色素基因MC1R的原核表达及多克隆抗体的制备

1、试验材料

1．1 菌株及载体

1．2 材料与试剂

1．3 主要仪器设备

2、试验方法

2．1 乌骨鸡mRNA的提取

2．2 反转录cDNA的合成

2．3 目的基因的合成

2．4 重组表达载体pET-32a-MC1R的构建

2．5 重组表达载体pET-32a-MC1R的诱导表达

2．6 重组蛋白的纯化回收

2．7 抗乌骨鸡MC1R多克隆抗体的制备

3、结果与分析

3．1 乌骨鸡MC1R基因的PCR扩增

3．2 目的片段的克隆及鉴定

3．3 重组质粒pET32a-MC1R的酶切鉴定

3．4 乌骨鸡MC1R核苷酸序列及氨基酸序列分析

3．5 重组菌体的诱导表达和SDS-PAGE分析

3．6 抗血清效价的测定

4、讨论

4．1 乌骨鸡MC1R基因序列分析

4．2 酶切位点的选择

4．3 表达系统的选择

4．4 多克隆抗体的制备

试验二 乌骨鸡黑色素基因MC1R的真核表达

1、材料

1．1 菌株与细胞

1．2 载体

1．3 主要试剂

1．4 主要仪器设备

2、方法

2．1 山羊成纤维细胞的培养

2．2 pEGFP-N1-MC1R真核表达载体的构建

2．3 以电穿孔法将重组载体pEGFP-N1-MC1R转染山羊成纤维细胞(以线性化的pEGFP-N1载体为阴性对照)

2．4 转染细胞阳性克隆的RT-PCR鉴定

2．5 乌骨鸡MC1R蛋白表达的免疫印迹检测

3、结果

3．1 pEGFP-N1-MC1R真核表达载体的PCR及酶切鉴定

3．2 转染后山羊成纤维细胞的培养

3．3 转染细胞阳性克隆的RT-PCR鉴定

3．4 蛋白表达产物的Westem blot鉴定

4、讨论

4．1 关于外源G蛋白偶联受体的表达问题

4．2 关于真核表达载体系统的选择

4．3 细胞克隆的RT-PCR鉴定

全文总结

参考文献

致谢

附录

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