狂犬病病毒快速荧光灶抑制试验(RFFIT)的建立与初步应用

摘要

狂犬病是一种重要的人兽共患传染病，近年来狂犬病在我国的发生呈逐年上升的趋势，究其原因，除了免疫措施不到位、免疫效果低下之外，无法及时对狂犬疫苗免疫后血清中和抗体效价进行检测，因此不能实现人群及动物种群的免疫检测也是主要原因之一。按照世界卫生组织(WHO)及国际兽疫局(OIE)的要求，人或动物接种狂犬病疫苗后，需测定其血清内的抗狂犬病病毒(Rabiesvirus，RV)中和抗体效价，不低于0.5IU/ml[1]时，方可认为达到有效保护，否则应予加强免疫，直至达到保护水平。
　　 当前，检测狂犬病病毒中和抗体国际通用方法主要包括小鼠中和试验（MNT）、荧光抗体病毒中和试验(FAVN)和快速荧光灶抑制试验（RFFIT）。其中MNT法操作比较复杂，需要在动物P3实验室进行且实验周期长，难以推广应用和达到快速检测;FAVN是以100TCID50的狂犬病病毒完全被血清抑制作为判定标准，是国际狂犬病参考实验室最主要的动物狂犬病中和抗体监测方法，主要用于犬血清的检测;快速荧光灶抑制试验(RFFIT)是用80％最适感染量的病毒与抗狂犬病血清相中和，计算出中和50％病毒量的最高血清稀释度，并与已知效价的血清标准品对照计算出血清中和抗体效价，RFFIT方法操作简便快捷，重复性好，整个实验过程比MNT和FAVN耗时短，是WHO和OIE的现行推荐方法之一，也是我国药典规范应用的狂犬病病毒中和抗体检测方法，既可用于人的狂犬病病毒中和抗体测定，也可用于动物的狂犬病病毒中和抗体测定。目前，我国只有武汉生物制品研究所和中国药品生物制品检定所具有本项技术，本研究于中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所脑炎室进行，以便在疾病预防控制系统建立此方法并进行初步应用。
　　 本研究结果建立了狂犬病病毒中和抗体快速荧光灶抑制试验（RFFIT），初步应用成功。
　　 本研究首先培养BSR细胞，低代次传代培养后进行了冻存，共冻存了40管，建立了BSR细胞库。用直接免疫荧光试验方法(DFA)测定狂犬病毒标准攻击种病毒CVS-11株的滴度为1.7×107FFU/ml，按照MOI=0.1的比例接种BSR细胞，制备CVS-11贮存用病毒库共500ml，并分装于冻存管冻存于-80℃冰箱内储存。同样用DFA的方法测定贮存用病毒的滴度为2×107FFU/ml;测定贮存病毒的最适攻击量为6×106FFU/ml，应用于RFFIT试验中;设定病毒对照、细胞对照、标准血清对照、阴性血清对照、强阳性血清对照和弱阳性血清对照六项对照系统，以Reed&Muench法公式和MicrosoftExcel软件为基础，设计被测样品中和效价计算公式。应用建立好的RFFIT系统进行大批量的血清检测，评价该检测系统的特异性、敏感性、稳定性和可重复性，结果表明本实验室建立的RFFIT检测系统可以应用于狂犬病特异性中和抗体的检测。
　　 国产成大疫苗分别按照五针法和2-1-1四针法肌肉注射免疫程序对112位志愿者进行暴露前免疫接种，然后分别在接种第0、7、14、45天时进行采血，共采集血清标本471份。用RFFIT方法对采集的471份血清进行狂犬病中和抗体的检测，结果:国产成大疫苗五针法免疫和2-1-1四针法免疫所得到的免疫效果差异在统计学上没有意义，其中2-1-1四针法免疫后第七天的中和抗体GMT比五针法稍高，且阳转率也要稍高于五针法;国产成大疫苗2-1-1四针法和进口鸡胚疫苗2-1-1四针法的免疫效果差异在统计学上没有意义，其中第七天的阳转率也要高于进口鸡胚疫苗。
　　 近年来中国人用狂犬病疫苗的生产量不断增加，每年因狂犬病暴露而接受暴露后治疗人数接近1000万，但暴露后治疗的监测由于缺乏评价方法而难以实施。本研究成功建立了狂犬病病毒快速荧光灶抑制试验（RFFIT）检测体系，经初步应用表明该检测体系具有良好的特异性、敏感性、稳定性和可重复性，不仅能够应用于评价狂犬病中和抗体水平，还可以用于狂犬病实验室诊断、狂犬病免疫制剂的效价测定、新疫苗或新的免疫程序的效果评估等方面，该检测系统可以提升我国狂犬病的整体监测能力。

目录

摘要

英文缩写词表

引言

文献综述

实验内容

试验一 狂犬病病毒快速荧光灶抑制试验(RFFIT)方法的建立

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

5 小结

试验二 快速荧光灶抑制试验(RFFIT)的初步应用

1 材料

2 方法

3 结果

4、讨论

5 小结

论文总结和结论

参考文献

附录

致谢

攻读硕士期间发表的论文

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