终末期肝病患者肝组织和血清中乙型肝炎病毒转录体的对照研究

摘要

目的:1996年Schutz等建立用于检测肝组织内HBV全长型和顿挫型转录体的方法;此后,Su和Zhang等于2001年建立了从血清中检测这两种转录体的方法.该研究采用上述两种研究方法,分别选择HBsAg阴性和HBsAg阳性的肝癌、肝硬变、其他肝病患者及非肝病患者,以及其中部分手术治疗患者,收集其血清标本和手术切除的肝组织标本,提取核酸后经PCR检测其中XDNA、fRNA和trRNA,分析其产物与终末期肝病的关系.并首次对来源于同一患者的血清标本和肝组织标本中的病毒转录体进行对照研究,进一步阐明HBV转录体存在的意义.方法:实验一:病例选取该校唐都医院和西京医院普通外科2002/12-2003/08住院病人145(男102,女43)例,年龄8~73(平均46.85)岁;肝癌67例,肝硬化46例,其他肝病患者19例,非肝病患者13例.145例中HBsAg阳性者70例,其中HBsAg阳性/HBeAg阳性20例HBsAg阴性者75例,其中HBV免疫学完全阴性32例.血清标本收集:抽取患者静脉血 5ml,置于灭菌干燥无抗凝特制离心管内,取血后迅速于低温离心机4 ℃,3000g,离心25min,吸取上层血清并分装.-70℃保存备用.血清核酸提取及PCR:采用High pure viral nucleic acid kit提取血清核酸,终产物为50ul.以此核酸提取物为模板,txs+和txas-为引物,经PCR扩增HBx DNA.应用Titan One Tube RT-PCR System,txs+/txs<,2>+和txas<,5>-为引物,经一步法扩增fRNA和trRNA.PCR产物经琼脂糖电泳显示结果.实验二:选取实验一中部分手术患者49(男32,女17)例,年龄8~62(平均46.27)岁;其中肝癌16例,肝硬化25例,肝良性瘤4例,其他4例,49例中HBsAg阳性27例,其中HBsAg阳性/HBeAg阳性5例;HBsAg阴性22例,包括HBV血清学标志物完全阴性者12例.肝组织标本处理:肝组织标本手术切除后,立即置于液氮运输,-70℃冰箱保存.组织核酸提取采用TRIzol试剂,分别提取出DNA终产物300ul,RNA终产物50ul.PCR及RT-PCR:以DNA提取物为模板,txs+和txas-为引物,扩增HBx DNA.RNA提取物经过DNA酶处理后,然后采用两步法,RNA反转录成cDNA,再以cDNA为模板,txs+/txs<,2>+和txas<,5>-为引物,经两轮PCR扩增fRNA和trRNA.PCR产物经琼脂糖电泳显示结果并与血清中结果进行对照分析.

目录

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中英文缩略词表

前言

文献回顾

实验一血清中乙型肝炎病毒转录体的检测

0引言

1材料

2方法

3统计学方法

结果

讨论

结论

实验二肝组织与血清中乙型肝炎病毒转录体的对照研究

0引言

1材料

2方法

3统计学方法

结果

讨论

结论

小结

参考文献

附录

个人简历和攻读学位期间的研究成果

致谢