腺病毒介导促软骨生长因子基因转染兔自体骨髓基质干细胞修复关节软骨缺损的实验研究

摘要

目的 以复制缺陷的腺病毒Adeno-X<'TM>为基因转移载体,制备携带TGF-β1和BMP-7等促软骨生长细胞因子基因的高滴度腺病毒液,感染兔骨髓基质干细胞,利用外源性基因编码的生长因子诱导其表达软骨细胞表型.再将软骨前体细胞与同种异体骨基质明胶支架相复合,在体外构建组织工程化软骨,移植修复兔自体膝关节软骨缺损,观察该方法的可行性和有效性,以期找到一种较好的修复关节软骨缺损的方法.方法 (1)采用逆转录PCR方法自多种组织和细胞总RNA中扩增获得转化生长因子β1基因,经测序后与Genebank中序列进行比较分析.(2)将hTGF-β1和hBMP-7基因分别亚克隆至穿梭质粒p-Shuttle上,经PI-SceⅠ和I-CeuⅠ双酶切后与线性化腺病毒骨架质粒Adeno-X连接,构建重组腺病毒质粒.鉴定后再经Lipofectamine 2000转染HEK 293细胞,包装出高滴度的重组腺病毒液.(3)采用密度梯度离心法自骨髓中分离培养人骨髓基质干细胞,观察原代及传代MSCs形态特点、生长特性和特殊染色,探讨其作为软骨组织工程种子细胞的可行性.(4)用携带外源性目的基因的腺病毒感染人MSCs,观察感染前后MSCs形态及生长周期的变化,利用PCR、免疫组织化学染色及Western blot鉴定重组腺病毒目的基因表达情况.(5)取兔髂骨和四肢骨,经脱脂、脱钙、去蛋白处理获得骨基质明胶,与腺病毒感染后的兔MSCs共培养,在体外构建组织工程化软骨.并通过组织染色、电镜观察了解细胞在同种异体骨基质明胶上粘附、生长和合成分泌软骨基质成分的情况.(6)制备兔膝关节软骨全层缺损模型,以5'-溴-2'-脱氧尿嘧啶标记的组织工程化软骨移植修复缺损区,同时设缺损模型自行修复组、单纯骨基质明胶修复组和未经腺病毒感染骨髓基质干细胞复合骨基质明胶修复组进行对比.术后1月、3月取材,观察关节面修复情况,了解修复组织中细胞的分化和其合成基质的情况.结论 (1)用密度梯度离心法从髓腔中分离得到的单个核细胞,体外培养后经流式细胞仪检测表面标志证实为骨髓基质干细胞.分离获得的骨髓基质干细胞体外培养显示,作为组织工程的种子细胞以1-5代为佳.(2)重组腺病毒是一种良好的基因转移载体,利用其感染靶细胞可以表达出质、量满意的外源性目的基因蛋白.(3)骨基质明胶是一种良好的软骨组织工程的载体材料,有利于种子细胞的粘附生长,并能在体外构建组织工程化软骨.(4)骨髓基质干细胞经携带促软骨生成因子基因的腺病毒感染后,体外能向软骨细胞作定向分化,可用于制备组织工程化软骨,并且在体内修复软骨缺损效果良好.

目录

独创性声明和保护知识产权声明

缩略词表

前言

文献回顾

1.关节软骨损伤的机制及修复技术的发展

2.软骨组织工程学的进展

3.病毒载体为基础的基因治疗在骨科中的应用

实验一人转化生长因子β 1基因的克隆、鉴定和测序分析

实验二TGF-β 1基因腺病毒表达载体的构建

实验三骨髓基质干细胞的分离和特性观察

实验四腺病毒介导兔TGF-β 1和BMP-7基因体外诱导MSCs的分化

实验五组织工程化软骨的构建与观察

实验六组织工程化软骨体内修复关节软骨缺损

小结

参考文献

个人简历

致谢