磷酸钙骨水泥/纤维蛋白胶与基因修饰骨髓间充质干细胞构建组织工程骨的相关研究

摘要

背景:肿瘤及创伤等疾患引起的大块骨缺损一直是骨科医生面临的难题之一，长期以来国内外学者进行了大量相关研究与临床实践。近年来，随着细胞生物学和生物材料科学的发展，组织工程学作为高新技术领域中一门多学科交叉的新兴边缘学科应运而生，并得到了迅速的发展。利用组织工程学方法和手段修复骨缺损是一种全新的治疗模式，具有广阔的应用前景。但由于难以获得具有良好生物学活性的种子细胞，目前尚无一种方法能高质量地修复大块骨缺损并达到很好的远期疗效。BMP-2是BMPs家族的一员，在体外和体内实验中证明有诱导成骨、促进骨修复的作用。但外源性生长因子半衰期短，局部使用很快被稀释和代谢，故需反复大剂量使用，而且价格亦非常昂贵。通过何种方法使生长因子持续高效发挥作用一直是骨组织工程学研究的关键问题。 随着基因工程的发展，组织工程学与分子生物学有机结合，运用分子生物学的理论和技术，组织诱导因子、种子细胞及生物材料的相互作用，为研制能更有效地恢复、维持或改善病损组织功能的生物替代物即基因修饰组织工程奠定基础。特别是以病毒载体为基础的基因转移技术的应用，为组织工程学中细胞因子的获得提供了一条的新思路。腺病毒载体被认为是基因治疗中很有前途的重要工具，具有很多优点，如能有效转染增殖和非增殖细胞，蛋白表达水平高，没有插入性突变的危险，无包膜不易被补体灭活等。组织工程和基因工程的有机结合，为解决骨缺损修复问题带来了希望。本实验拟在以往的研究基础上，将具有多重生物学效应的hBMP-2基因通过腺病毒载体转入骨髓间充质干细胞(bonemarrowmesenchymalstemcells，BMSCs)，与用可吸收磷酸钙骨水泥(calciumphosphatecement，CPC)/纤维蛋白胶(fibringlue，FG)体外构建的复合支架材料复合，为用基因修饰组织工程学技术高质量地修复骨缺损奠定实验基础。 目的:以复制缺陷的腺病毒Adeno-XTM为基因转移载体，制备携带hBMP-2促骨生长细胞因子基因的高滴度腺病毒液，感染兔骨髓间充质干细胞，利用外源性基因编码的生长因子诱导其表达成骨细胞表型；用可吸收磷酸钙骨水泥/纤维蛋白胶体外构建符合骨组织结构的复合支架材料，取长补短，充分发挥CPC良好的力学性能以及与骨完全一致的无机晶格的优势，利用FG的粘性以增强CPC的力学性能，同时利用其对种子细胞的吸附及包裹作用，吸附基因修饰BMSCs构建成一种新型的基因修饰组织工程骨；并通过体外和体内实验评估所构建的组织工程骨，观察该方法的可行性和有效性，以期找到一种较理想的骨缺损修复材料。 方法:(1)采用全骨髓法自兔骨髓中分离培养兔BMSCs，观察原代及传代BMSCs形态特点、生长特性，摸索其诱导分化为成骨细胞的条件，探讨其作为骨组织工程种子细胞的可行性。(2)用携带外源性目基因BMP-2的腺病毒Adeno-XTM/BMP-2感染兔BMSCs，观察感染前后BMSCs形态及生长的变化，利用免疫组织化学染色及原位杂交从蛋白和mRNA水平鉴定感染后BMSCs重组腺病毒目的基因表达情况，并通过成骨细胞表型检测及碱性磷酸酶染色、钙结节Von-Kossa染色等方法观察其成骨分化的能力。(3)用可吸收CPC/FG体外构建符合骨组织结构的支架材料，通过X线衍射(X-raydiffraction，XRD)、扫描电镜(scanningelectronicmicroscope，SEM)、抗压实验和空隙率测试等方法对其凝结时间、力学性能及结构等理化特性进行分析，评价其作为组织工程骨支架材料的可行性。(4)将用可吸收CPC/FG复合支架材料与腺病毒感染后的兔BMSCs共同培养，在体外构建组织工程化骨。并通过组织染色、SEM等方法体外和体内观察了解细胞在支架材料上粘附、生长和合成分泌骨基质成分的情况。(5)制备兔桡骨缺损模型，以绿色荧光蛋白(greenfluorescenceprotein，GFP)标记的组织工程化骨移植修复缺损区，以示踪种子细胞的转归。同时设计缺损模型自行修复组(D组，实验对照)、单纯可吸收CPC/FG复合支架材料修复组(C组)，感染和未经腺病毒感染BMSCs复合可吸收CPC/FG复合支架材料修复(A和B组)组进行对比研究。术后4w、8w、12w取材，通过大体形态，X线摄片，单光子发射计算机断层摄影(singlephotonemissioncomputedtomography，SPECT)，组织学染色等方法观察骨缺损修复情况，了解修复组织中细胞的分化和材料的降解情况，综合评估所制备的组织工程骨的有效性。 结果:(1)经全骨髓法自兔骨髓中分离培养的兔BMSCs，其原代及传代BMSCs形态特点、生长分化特性符合干细胞的特点，自我增殖能力强；在成骨诱导体系(osteogenicsupplements，OS)或rhBMP-2的诱导下能分化为成骨细胞；并且体外扩增容易，适宜作为骨组织工程的种子细胞。(2)Adeno-XTM/BMP-2感染后兔BMSCs形态特征无显著变化，但细胞增殖加快，差异均有显著性意义(p＜0.05)；转染BMP-2后的BMSCs目的基因能高效表达，转染4w后仍能表达；转染BMP-2后的BMSCs无需诱导培养能表现出成骨细胞的结构特征和生物学特性，骨钙素含量均较未转染组有显著增高，差异均有显著性意义(p＜0.01)，免疫组化检测Ⅰ型胶原蛋白表达阳性，碱性磷酸酶染色和钙结节Von-Kossa染色阳性。(3)体外构建的CPC/FG复合支架材料所含的结晶相仍是羟基磷灰石(hydroxyapatite，HAP)，具有表面空隙密度大，三维空隙率小的特点，其抗压强度达到14MPa，弹性模量在96.64～269.39MPa之间。空隙率约38.8％，孔径10～100μm，不均匀分布，初凝时间为5.4±0.3min，终凝时间为7.5±0.3min；而相同条件下制备的纯CPC样品所含的结晶相是HAP，抗压强度达到9MPa左右，弹性模量在89.14～89.80MPa之间，空隙率约41.7％，孔径10～20μm，均匀分布，初凝时间为3.5±0.2min，终凝时间为7.2±0.2min。(4)转染BMP-2后的BMSCs能在CPC/FG复合材料及单纯CPC上粘附、增殖，并能分泌胶原和骨钙素；在相同符合条件下，CPC/FG复合材料的细胞粘附数量、增殖速度及分泌的骨钙素和碱性磷酸酶活性均大于单纯CPC；肌袋实验显示：转染BMP-2后的BMSCs与CPC/FG复合材料构建的组织工程骨能异位成骨，而单纯CPC/FG复合材料不能异位成骨。(5)兔桡骨缺损模型修复实验显示：GFP标记的BMSC能在回植4w后表达GFP；BMP-2基因转染的BMSC与CPC/FG复合材料、未转染BMSC与CPC/FG复合材料和单纯CPC/FG复合材料均能修复兔桡骨缺损，而对照组均未见骨缺损得到修复。但转染的BMSCs修复骨缺损的成骨速度及成骨量均优于未转染组，而未转Adeno-XTM/BMP-2组与单纯磷酸钙骨水泥/纤维蛋白胶材料组相比，无明显差异。 结论:(1)用全骨髓法分离培养的兔BMSCs，取材容易，体外扩增快，在成骨诱导下能分化为成骨细胞，适宜作为骨组织工程的种子细胞。(2)Adeno-XTM是一种方便高效的腺病毒表达系统，利用其可以使得目的基因得到有效表达，BMP-2是一种良好的骨诱导生长因子，而BMSC是基因转染的理想靶细胞，利用Adeno-XTM腺病毒表达系统转染BMP-2以修饰BMSC的基因治疗策略是可行的。(3)CPC/FG复合支架材料具有一定的力学强度和良好的生物学性能，有利于种子细胞的粘附生长，并能在体外构建组织工程化骨。(4)以CPC/FG复合支架材料与BMP-2基因修饰BMSCs构建的组织工程骨能异位成骨，具有良好的修复大块骨缺损的能力，是较理想的骨替代材料。

目录

独创性声明及保护知识产权声明

缩略语表

前 言

文献回顾

实验一 兔骨髓间充质干细胞的体外培养和特性观察

实验二 hBMP-2基因转染兔骨髓间充质干细胞的表达及生物学效应的观察

实验三 CPC/FG复合支架材料的凝结时间、力学性能及结构分析

实验四 组织工程化骨的构建与评测

实验五 hBMP-2基因增强的组织化工程骨修复兔桡骨节段性缺损

小结

参考文献

个人简历和攻读学位期间的研究成果

致 谢