小鼠胚胎干细胞SM22α-EGFP表达克隆的建立及血管平滑肌细胞体外发育的动态观察

摘要

研究背景及目的:动脉粥样硬化、再狭窄及高血压等心血管疾病的重要特点之一是血管平滑肌细胞(VSMCs)的异常生长及增殖。成熟动物体内的VSMCs可表达一系列收缩蛋白、离子通道及信号分子，这些蛋白对于VSMCs的首要功能——收缩是必需的。然而，在各种损伤性刺激的作用下，VSMCs可以去分化，由静止的收缩表型向增殖能力明显加强的合成表型转换。了解VSMCs发育及分化的过程不仅有助于阐明如何在心血管病中阻断这一异常转换，而且对了解先天性血管发育缺陷及肿瘤的血管发育至关重要。然而，目前对于VSMCs特异分化及终末分化诱因的研究非常有限，原因之一是缺乏一种合适的VSMCs发育模型。由于在体内无法获得发育早期的VSMCs，胚胎干细胞(ESCs)为早期VSMCs的谱系形成、分化及成熟机制的研究提供了一种有价值的体外模型。ESCs的特点是可以在培养期间长期保持未分化状态，同时保留分化成任何一种三胚层来源细胞的能力。在体外，ESCs可以自发地分化成胚胎小体(EBs)。EBs可以生成高度分化的细胞，包括VSMCs，并可以模拟早期胚胎发育时的许多过程。因此，本研究的目的是对ESCs来源的VSMCs进行标记并对其进行动态观察。我们建立了在VSMCs特异性蛋白SM22α启动子控制下稳定表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的ESCs株，证明这些转基因的ESCs在发育早期可以表达VSMCs特异性的EGFP，并使一群EGFP阳性、具有VSMCs形态及免疫细胞化学特性的细胞亚系得到了确认。 材料与方法: 1.细胞培养小鼠ESC细胞株R1(ATCC)培养于丝裂霉素(10μg/mL，2h)处理后的滋养层细胞STO(小鼠成纤维细胞株)上。ESCs在生长到亚融合状态时行传代，每天换液以维持其未分化状态。 2.载体构建541bp的VSMCs特异性SM22α启动子序列经PCR法获得。将该片段插入到T载体中构成PTSM载体，再经SAC-1及APA-1双酶切后亚克隆至无启动子的EGFP报告载体(PEGFP-1)中构成PSM-EGFP载体。 3.ESCs转染用电穿孔法将线性化的PSMEGFP载体转染到ESCR1细胞。将转染后的ESCs(SM22α-EGFP)在含G418的选择性培养液中培养和筛选。将扩增后10d的转基因ESCs于解剖显微镜下用Pasteur枪头挑取1.5mm～2mm的细胞克隆行扩增培养。 4.基因组PCR鉴定应用TaqPCR试剂盒行基因组DNAPCR分析。所扩增片段为PEGFP-1载体中EGFP的cDNA序列。 5.ESCs分化及EBs模型的建立ESCs细胞培养至亚融合状态，用0.25％胰酶及0.53mmol/LEDTA消化后，铺于明胶包被的培养皿中，3h后大部分STO细胞已贴壁。将未贴壁的ESCs稀释后接种于细菌培养皿中，培养液除无LIF外与ESCs培养液相同。悬浮培养后6d，将EBs接种于0.1％明胶铺被的培养皿中贴壁培养，每天换液。 6.免疫细胞化学染色固定的EBs经0.05mol/LTBS中洗涤后，在含0.25％TritonX-100和0.5mol/LNH4Cl的TBS中通透20min。5％牛血清白蛋白室温封闭1h后，与一抗在4℃孵育过夜。抗小鼠抗体包括SMα-actin、Flk-1、Caspase-3及SMMHC。二抗为四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)或FITC标记抗体。 7.RT-PCR参照说明书用Trizol提取不同时间点EBs中的RNA。取1μgRNA进行以下物质的半定量PCR：Pecam-1(CD31)、SM22α、myocardin、EGFP及GAPDH。 8.慢速显微摄像技术(time-lapse)将EBs接种于35mm培养皿中，置5％CO2，37℃恒温小室，在配有自动摄像装置(CoolSNAPfx)的倒置相差显微镜(OlympusⅨ-70)下观察细胞移行，每隔10min作序列摄影，连续拍摄39张，共6.5h。迁移速率采用图像分析软件(Image-ProPlus5.1)示踪程序对累积移行距离及速率实施分析测定。 结果: 1.SM22α-EGFP表达载体构建及阳性ESCs克隆筛选以小鼠STO细胞DNA为模板扩增得到541bp特异性目的基因片段，与预期片段大小一致。为验证插入序列，分别对PTSM和PSME-GFP两种质粒行ECORⅠ和SMAⅠ酶切鉴定，酶解产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳分析证实片断大小与理论计算相符合。用电穿孔法将线性载体转染至ESCs，随后对转染ESCs实施筛选，转染后第6d可见G418耐药性克隆。共扩增24株ESCs细胞克隆，有4株经基因组PCR证实为阳性。以下实验结果均来自1号克隆，为4株阳性克隆之一。 2.EBs模型的建立及形态特征R1细胞在STO细胞上呈团生长，细胞致密，边界不清。EBs从第3d开始形成，此后体积逐渐增大。在第6d可见EBs中心部分透光性逐渐减弱，呈黑色坏死区，Caspase-3免疫荧光染色可见EBs中心存在大量凋亡细胞。第6dEBs贴壁后可向四周分化延伸出各种形态细胞，免疫荧光染色证实有VSMCs形成。 3.ESCs细胞分化过程中VSMCs特异性EGFP的表达时相为分析VSMCs分化表达SM22α-EGFP的时间变化特征，观察不同时间点EBs分化细胞中EGFP的表达。发现EBs在第6+5d(悬浮培养6d后贴壁培养5d)细胞表达荧光，EGFP阳性细胞随培养时间延长逐渐增多，在第6+24d达到高峰。EGFP表达主要定位于细胞浆内。SM22α启动子可在体内VSMCs中特异性地被启动。与肌动蛋白异构体不同的是，SM22α只在VSMCs中表达。此外，与钙调蛋白、肌动蛋白相关蛋白(metavinculin)及肌球蛋白重链不同之处在于SM22α无剪接变异体。SM22α的启动子序列较短，更易克隆。已有研究显示，转录起始位点上游441bp的SM22α启动子足以启动基因的表达，这一点在本实验中得到了进一步证实。 4.EBs中分子标志物的表达为了进一步验证EGFP阳性细胞系VSMCs，选取第6+17dEGFP阳性的EBs。免疫荧光染色证实EGFP阳性细胞SMα-actin及SMMHC染色均为阳性，表明SM22α-EGFP转染ESCs细胞中报告基因表达具有VSMCs特异性。对不同时间点ESCs分化形成的EBs实施RT-PCR分析，随时间的延长EGFP及VSMCs特异性标志物表达水平逐渐增加，同时观察到内皮细胞(ECs)特异性标志蛋白PECAM-1具有相同的表达时相，提示在EBs分化过程中有ECs形成。在野生型ESCs分化形成的EBs中亦观察到VSMCs分化伴有ECs生成。本实验结果显示，在EBs模型中SM22α启动子能启动VSMCs特异性EGFP表达，进一步用免疫荧光染色及RT-PCR证实EGFP阳性细胞可以表达其它VSMCs特异性标志物，从而证实这些细胞为VSMCs，而不是心肌或骨骼肌细胞。先前的在体内实验与本实验结果一致：SM22α启动子只启动心血管系统SMCs报告基因的表达，而内脏系统SMCs无报告基因表达，提示SM22α控制下的报告基因具有心血管系统特异性。 5.VSMCs异质性采用本模型可以观察到VSMCs形态呈多样性。大致可分为两类：①纺锤形，散在分布于EBs的延伸细胞中；②上皮样多角形细胞，成群出现，主要位于细胞密度最大的EBs中心部位。此外，两种细胞的迁移速率不同，前者移行伴有明显的细胞收缩变形，后者相对维持原有细胞形态。纺锤形细胞的迁移速率较上皮样多角形细胞的速率快。形态和迁移速率的差异提示可能存在两种表型VSMCs。获得整合有SM22α-EGFP序列的ESCs具有以下几个意义：首先，证明了SM22α启动子在EBs模型中的调控表达具有VSMCs特异性。人SM22α启动子序列可以对骨髓基质细胞分化而来的VSMCs进行分选。其次，该模型可以容易地检测到EBs的每一个细胞中SM22α启动子的活性，而以前胚胎发育研究中沿用的报告基因多数是lacZ(β-半乳糖苷酶)，其分析过程较本法繁琐费时。第三，SM22α-EGFPESC克隆为筛选VSMCs分化所用诱导剂及抑制剂提供了一个较好的培养体系。最后，重组的ESCs可培育出VSMCs中有EGFP表达的小鼠，用于针对VSMCs在各种病理条件下分化调节机制的研究。利用整合有SM22α-EGFP序列的ESCs，结合相关细胞因子协同的有序诱导，能够建立一套高效诱导ESCs细胞分化为VSMCs的诱导培养体系。本模型中的两种不同形态细胞是否能代表成体VSMCs的增殖及迁移表型，以及它们之间VSMCs特异性基因表达谱的差异还需进一步研究证实。 结论:应用PCR等方法成功克隆SM22α-EGFP表达载体，并应用电穿孔方法成功转染ESCsR1细胞，建立SM22α-EGFP表达克隆株。ESCs通过悬浮培养，建立EBs模型。在该模型中观察到VSMCs和ECs的分化。起源于SM22α-EGFPESCs形成的EBs在第11d开启SM22α启动子并表达EGFP。此后EGFP阳性细胞持续增加，在第30d达到高峰。EBs中VSMCs形态可分为纺锤形及上皮样的多角形，纺锤形细胞迁移速度较上皮形细胞快。

目录

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缩略语表

前言及文献回顾

第一部分小鼠胚胎干细胞SM22 α-EGFP表达克隆的建立

第二部分小鼠血管平滑肌细胞体外发育的动态观察

个人简历和研究成果

致谢