人工进化丙型肝炎病毒（HCV）C和E1区噬菌体展示文库的构建及初步筛选

摘要

丙型肝炎病毒(HCV)是引起慢性肝脏疾病的主要原因之一，并与肝硬化和肝癌的发生密切相关。全世界约有1.7亿HCV感染者，HCV的感染越来越引起人们的重视。HCV基因序列的高度变异性，主要表现为病毒各种基因型、亚型及准种变异的存在和免疫逃避现象，使病毒得以逃避宿主免疫系统的作用而造成病毒的持续感染，因而难以治疗及预防。HCV没有理想的细胞模型，除黑猩猩外也没有方便的动物模型，这使HCV致病机制及疫苗的研究遇到了极大的困难。DNA改组技术，通过基因在分子水平上的重组，改变基因原有核苷酸序列，创造新基因，并定向筛选具有预期性状的突变体，赋予表达产物以新的功能。它是一项全新的体外人工进化模式，是迄今为止所知道的最有效的分子进化技术。噬菌体展示技术(PDT)是利用丝状噬菌体外壳蛋白来展示外源多肽的新技术。它使随机肽库和编码他们的DNA序列联系起来，通过和特异性的靶分子(抗体、酶、细胞表面受体等)进行结合，可以快速地从肽库中筛选出所需的目的基因。HCV的编码基因呈高度变异性，机体感染HCV后易发生免疫耐受，因此，采用传统方法难以获得对不同HCV株型同时具有防治功效的疫苗。要克服这种免疫耐受现象，就必须避开高变区，选择相对保守区进行实验，同时诱导机体产生对预防和清除不同株型HCV感染具有重要作用的体液及细胞免疫应答。核心区(C区)序列具有高度遗传保守性，C基因表达产物具有良好的抗原稳定性。在自然感染病程中，核心蛋白已显示出能诱导产生细胞免疫和体液免疫。E1蛋白可能对于病毒的脱壳、进入细胞、与内质网膜结合等病毒-细胞的相互作用中起着重要作用。因此，C和E1具有的多种功能促使人们从不同角度对其进行研究，以期探讨HCV的致病机制，为预防和治疗HCV感染提供新的策略。 本研究主要进行了如下工作： 1.丙型肝炎病毒C和E1区的DNA改组利用DNA改组技术进行不同基因型的HCVC和E1区的人工进化。首先，以1a和1b基因型HCV质粒载体为模板，利用PCR扩增了两段具有较高序列同源性的1kb左右的基因片段，两者相比较同源性大于83％。然后将其等量混合后，在Mg2+存在的条件下，用DNaseⅠ切割成50bp左右的小片段。这些小片段在不外加引物的条件下，利用PCR反应进行重聚，再将重聚物经过一轮正常的PCR扩增。结果获得了与原来片段大小相当的基因片段。DNA改组技术为进一步筛选高活性的丙型肝炎病毒C和E1区基因打下基础，有利于从一组序列同源性程度较高的基因库构建随机嵌合基因，并为改组其他基因家族提供了借鉴。 2.人工进化丙型肝炎病毒C和E1区噬菌体展示文库的构建将通过DNA改组技术进行人工进化获得的HCVC和E1区基因，克隆于噬菌体载体pCANTAB5S，电转化抑制型大肠杆菌E.coliTG1，构建人工进化HCVC和E1区噬菌体展示文库，库容为1.64×106。噬菌体的库容和多样性能够满足筛选的要求。以辅助噬菌体M13KO7援救后，得到噬菌体滴度为1.86×1011cfu/ml的次级噬菌体库。这为下一步文库的初步筛选奠定了基础。 3.人工进化丙型肝炎病毒C和E1区噬菌体展示文库的初步筛选以C和E1区单克隆抗体对噬菌体展示文库进行4轮淘筛，在抗体包被量逐轮减少的情况下，产率逐渐升高，说明能与单克隆抗体特异性结合的阳性噬菌体克隆得到了特异性富集。然后，随机选取筛选后的20个噬菌体克隆，用高滴度HCV阳性血清通过双抗体夹心ELISA进行抗原抗体结合反应，以正常人血清作为对照。结果表明12个克隆具有较好的特异结合活性，而与正常人血清无特异反应，表现出较好的亲和力。 结论： 1.成功进行了丙型肝炎病毒C和E1区的人工进化。 2.成功构建了人工进化丙型肝炎病毒C和E1区噬菌体展示文库。 3.对人工进化丙型肝炎病毒C和E1区噬菌体展示文库进行了初步筛选，证实人工进化的C和E1区克隆具有抗原性和交叉反应性。 4.本研究为提高HCV的血清学诊断水平及研制新型疫苗打下基础，由此产生的疫苗可能预防不同型别毒株间的交叉感染。

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