脂肪来源的干细胞（ADSCs）的可塑性及在修复牙槽骨缺损中的实验研究

摘要

随着组织工程技术的不断发展，种子细胞的来源问题已经成为制约其发展的一个重要的因素。自ADSCs发现以来，人们对其的研究不断深入。近几年，越来越多的实验证实，ADSCs可以向成骨细胞、成软骨细胞、神经细胞、肌细胞和脂肪细胞等不同胚层来源的细胞分化。而且脂肪组织来源广泛、取材容易、便于自体移植；ADSCs在体外长期培养的过程中始终保持其多向分化潜能、遗传背景相当稳定、体内植入后少有免疫排斥的问题，因而是一种非常理想的组织工程种子细胞。本课题对其生物学特性、可塑性以及复合PLGA后对修复牙槽骨的缺损进行了研究，以期为ADSCs进一步的应用提供实验依据。 第一部分目的：研究ADSCs的生物学特性及遗传学特性。方法：从人脂肪组织中分离出干细胞；利用倒置显微镜观察其形态；利用细胞计数试剂盒(cellcountingkit-8)测定其生长特性；利用流式细胞仪检测其表面标志及细胞周期；利用染色体核型分析技术检测第20代细胞的遗传学特性。结果：ADSCs在体外呈长梭形；群体倍增时间约为29h；在其表面分子中CD29、CD90、CD44呈阳性；对数生长期的细胞80％以上处于G0和G1期；第20代细胞仍具有正常的二倍体核型。结论：ADSCs分离培养容易、增殖速度稳定、增殖能力较强、遗传学稳定性良好。 第二部分目的：检测ADSCs的可塑性。方法：①利用地塞米松、抗坏血酸、β-甘油磷酸钠等将其向成骨细胞诱导分化，并对诱导21d后的细胞进行AKP和VonKossa染色；②用3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(isobuty1-methylxanthine，IBMX)、地塞米松、胰岛素、吲哚美辛等将其向脂肪细胞诱导分化，并对诱导21d后的细胞进行油红O染色；③利用3bFGF、ATRA(全反维甲酸)、BME、BHA及DMSO等将其向神经细胞诱导分化，并对诱导14d后的细胞进行NSE和GFAP免疫组织化学染色；④利用HGF和FGF-4等将其向肝细胞诱导分化，对诱导7d和14d后的细胞进行AFP、CK-18和ALB的免疫荧光染色，利用RT-PCR的方法检测诱导7d和14d后的细胞目的基因的表达量；⑤利用bFGF和EGF等将其向内皮细胞诱导分化，并对诱导14d后的细胞进行VWF、FLT-1、FLK-1和CD34免疫荧光染色。结果：向成骨细胞诱导后，AKP和VonKossa染色均为阳性；向脂肪细胞诱导后，油红O染色阳性；向神经细胞诱导分化后，NSE和GFAP免疫组织化学染色均为阳性；向肝细胞诱导分化后，分化后的细胞AFP、CK-18和ALB的免疫荧光染色均为阳性，RT-PCR结果显示：分化后的细胞均表达AFP、CK-18和ALB；向内皮细胞诱导分化后，VWF、FLT-1、FLK-1和CD34免疫荧光染色均为阳性。结论：ADSCs可以向成骨细胞、脂肪细胞、神经细胞、内皮细胞和肝细胞等三个不同胚层来源的细胞分化，具有良好的可塑性。 第三部分目的：以兔ADSCs为种子细胞，PLGA为支架材料，通过组织工程的原理和方法修复牙槽骨缺损。方法：取兔腹股沟处脂肪垫，用差异贴壁的方法分离培养ADSCs；条件培养基体外诱导后进行免疫组织化学染色；将细胞和支架材料复合，扫描电镜观察细胞和支架材料的生物相容性；制备动物模型，将实验分为四组：预诱导实验组移植附着细胞的且经过体外预诱导3d的PLGA；非预诱导实验组移植附着细胞的且不经过体外预诱导的PLGA；材料对照组移植单纯的支架材料；空白对照组不做任何处理。12周后处死动物，组织学方法检测新骨形成情况，比较各组之间的差异。结果：体外经过诱导的ADSCs表现出了成骨细胞的活性；扫描电镜结果显示：细胞在支架材料表面生长良好，呈长梭形。12周后，预诱导实验组骨再生高度为3.7mm±0.6mm，修复率为74％；非预诱导实验组骨再生高度为2.8mm±0.6mm，修复率为56％；材料对照组骨4再生高度为1.1mm±0.4mm，修复率为22％；空白对照组骨再生高度为0.9mm±0.5mm，修复率为14％。两实验组之间以及实验组与对照组之间的牙槽骨再生高度以及修复率均有显著性差异。结论：利用PLGA复合自体ADSCs有良好的新骨形成能力，在牙槽骨和颌骨缺损中有着良好的应用前景。 综上所述，本课题进一步阐明ADSCs的生物学特性和遗传学特性，并将ADSCs在一定条件下向内胚层、中胚层和外胚层来源的细胞诱导分化。首次报道了ADSCs向肝细胞诱导分化，并利用PLGA复合ADSCs成功修复家兔的牙槽骨缺损。

目录

独创性声明及保护知识产权声明

缩略语表

前言

文献回顾

设备与材料

第一部分ADSCs的生物学特性的研究

第二部分ADSCs可塑性的实验研究

第三部分ADSCs在修复牙槽骨缺损中的实验研究

全文总结

参考文献：

个人简历

致谢