新疾病——外伤后细菌性致死性肉芽肿病原菌分子生物学鉴定及发病机制初步探索

摘要

引言：外伤后细菌性致死性肉芽肿(Fatalbacteriagranulomaaftertrauma，FBGT)是由高天文教授发现并命名的一种新疾病，该病在面部外伤愈合后发生，预后极差，患者死亡时均有脑部受累症状。以往国内多位专家曾先后诊治过近20例，进行了认真的普通细菌分离、厌氧菌分离、真菌培养等研究，均未获阳性结果；曾诊为“结节病、真菌感染”，给予糖皮质激素、抗生素、抗结核、抗真菌等治疗，效果不佳，患者全部在发病后的1到4年内死亡。在总结、分析前人分离、培养该病病原失败的基础上，采取严格厌氧、运送培养基及增菌肉汤等改进措施后，本课题组其他成员终于成功地从4例FBGT患者的皮损组织中分离培养出病原菌，初步研究表明该菌为革兰阳性杆菌，但具体种属不明。由于病原菌种属、患者的致死机理等不明，尽管采取各种积极的治疗措施，除我们所救治的6例患者中有1例获救外，至今尚无救治成功的病例。FBGT的发病机制、致死机理的阐明已成为救治患者的关键。 目的： 1.分别采取PCR扩增FBGT患者皮损分离病原菌16SrRNA、测序结果BLAST比对及患者分离菌与P.acnes标准株DNA杂交方法明确病原菌的种属；采用细菌16SrRNAPCR的方法，检测2例行尸检患者(病例2和3)的病变脑组织是否存在细菌，阐明患者死亡原因，测序结果与皮损分离菌序列比对，明确脑内细菌是否与各自患者皮损分离菌为同一细菌，进一步证实从患者皮损分离的细菌就是FBGT的病原菌。 2.通过PCR扩增病例2的IFN-γ相关分子(IAM，包括IFN-γR1、R2、STAT1、IL-12β、IL-12Rβ1、β2和STAT4)的所有外显子，测序结果与多个数据库的野生型序列比较，寻找可能引起相应的IAM分子功能缺陷的多态性位点，初步明确FBGT的发病机制。 方法： 1.FBGT患者皮损分离病原菌分子生物学鉴定及死亡原因分析 1)4例FBGT患者皮损分离病原菌16SrRNA鉴定 (1)提取皮损分离菌的基因组DNA； (2)利用细菌通用引物扩增皮损分离菌的16SrRNA； (3)测序结果通过BLAST与已知细菌的16SrRNA序列进行同源 性比对，明确FBGT患者皮损分离菌的具体种属。 2)皮损分离病原菌与P.acnes标准株DNA杂交 (1)DNA结合：采用共价法结合DNA到微孔板法进行DNA-DNA杂交，每个样品4个平行重复； (2)标记DNA：photo-activatablebiotin(PAB)标记探针DNA； (3)杂交 (4)测定杂交率：50℃杂交12小时，分别用2×SSC-0.1％Tween2050℃和室温洗3次(15分钟)，碱性磷酸酶法FLUOstarOPTIMA(BMD)测定杂交率(360nm激发和460nm辐射)。 3)2例死亡患者病变脑组织细菌16SrRNA检测、死亡原因分析(1)提取2例行尸检患者(病例2和3)的病变脑组织基因组DNA； (2)病变脑组织细菌16SrRNAPCR检测，明确患者死亡原因； (3)测序结果分别进行BLAST比对，初步明确病变脑组织内细菌的种属，并与各自患者皮损分离菌的16SrRNA序列进行比较，明确病变脑组织内的细菌与皮损分离菌是否为同一细菌，进一步证实皮损分离菌就是FBGT的病原菌。 2.IAM基因外显子扩增、功能缺陷多态性位点确定在本课题第一部分已明确P.acnes就是FBGT的致病菌的基础上，通过综合分析FBGT患者的表型，结合P.acnes毒力低，为胞内寄生菌等特点，充分借鉴他人研究成果，提出了IAM基因多态性是FBGT发病的重要机制的假说。进行了以下工作： 1)设计IAM相关分子基因所有外显子(包含5'和3端的片区)的引物，并对引物进行BLAST比对，确保特异扩增； 2)PCR扩增，直接测序，测序结果与多个基因多态性数据库(http：//egp.gs.washington.edu/、Genecard等)的野生型序列比较，找出多态性位点； 3)针对此多态性位点重新设计引物，无关正常对照(10人)的相应外显子PCR扩增，直接测序，证实正常人不存在此多态性位点； 4)通过PCR—单酶切分析进一步证实病例2的多态性位点，并明确等位基因型； 5)综合分析所发现多态性位点对相应基因的结构(三维构像等)、表达和功能可能的影响，进而确认能引起相应分子功能缺陷的多态性位点，初步明确FBGT的发病机制。 结果： 1.FBGT患者皮损分离病原菌16SrRNA鉴定、病变脑组织细菌16SrRNA检测和死亡原因分析 1)4例FBGT患者皮损分离病原菌16SrRNA基因序列经BLAST比对后与已知P.acnes(AB097215.1GI：26006299)的同源性达99％，皮损分离病原菌为P.acnes; 2)2例尸检患者病变脑组织内均可检测到细菌16SrRNA片段，患者死于细菌引起的脑感染；PCR测序结果与相应患者皮损分离菌的16SrRNA序列完全一致，脑内细菌与皮损分离菌为同一细菌。 2.IAM基因外显子扩增、功能缺陷多态性位点确定 1)通过PCR测序与数据库比对，发现IAM重要成员-IL-12Rβ1基因第五外显子存在一个错义突变(271G→A)，可引起所编码氨基酸的改变(91T→A)，未发现其他IAM分子基因外显子存在无义或错义突变； 2)检索多个多态性数据库(http：//egp.gs.washington.edu/、Genecard等)，未发现与IL-12Rβ1基因第五外显子错义突变(271G→A)一致的多态性位点； 3)10名正常对照IL-12Rβ1基因第五外显子在相应多态性位点均为野生型(271G/G)； 4)PCR-NaeI单酶切分析进一步证实病例2的IL-12Rβ1基因第五外显子突变为为纯合型错义突变(271A/A)： 5)IL-12Rβ1的错义突变(271G→A)位于配体识别的关键区域，该突变可引起所编码氨基酸的理化性质改变(疏/亲水性)，进而引起IL-12Rβ1三维构像改变，综合分析证实此错义突变(271G→A)可引起IL-12Rβ1与配体结合能力下降，导致IL-12Rβ1功能缺陷。 结论： 1.本研究在以往研究的基础上，通过分子生物学方法明确了P.acnes为新疾病FBGT的病原，患者的死亡原因为P.acnes所致的脑感染。 2.依据FBGT的临床特点，通过广泛查阅相关文献，提出IAM基因多态性引起相应分子功能的缺陷是FBGT发病机制的假说；以此为基础，检测了病例2的IAM基因的所有外显子，发现IAM的重要成员-IL-12Rβ1第5外显子存在1个错义突变(271G→A)，综合分析发现该突变可引起编码氨基酸疏水性改变，突变氨基酸位于配体结合的关键区域，可引起IL-12Rβ1与配体结合能力下降，导致IL-12Rβ1功能缺陷，进而导致IAM的核心分子-IFN-γ表达障碍，通过对1例患者的深入研究，证实了提出的FBGT发病机制假说。

目录

独创性声明及保护知识产权声明

缩略语表

前言

第一部分：FBGT病原菌分子生物学鉴定

1文献回顾

2材料和方法

3结果

4讨论

小结

参考文献

第二部分：FBGT发病机制初步探索

1文献回顾

2课题设计思路，研究对象和实验方法

3结果

4讨论

总结

参考文献

个人简历

致谢