百草枯、代森锰联合暴露对多巴胺能系统的损伤及饮食限制对其的保护作用

摘要

帕金森病（Parkinson’s disease，PD）是中老年人最常见的中枢神经系统退行性疾病之一，发病率仅次于阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）。 PD的病变特征是黑质——纹状体多巴胺（Dopamine，DA）能系统功能受损，但发病机制至今尚不明确。目前认为PD 是由遗传、环境及老龄等因素共同作用的结果。百草枯（Paraquat，PQ）是一种除草剂，代森锰（Maneb，MB）是一种杀真菌剂，他们属于农业化学药品范围，在很多地理区域常联合使用。 PQ、MB 都具有一定的中脑DA 能神经元损伤效应，但目前明确的观点是两者合用时能够产生更稳定的协同效应，且与人类散发性PD 的多重环境危险因素暴露条件相近。因此，PQ 和MB 联合（PQMB）诱导DA 能系统损伤是研究散发性PD 的有效手段之一。 饮食限制（Dietary restriction，DR）能够显著延长实验动物的生存期，诱导大鼠和小鼠脑内神经元产生良性应激反应，具有神经保护作用并能改善多种老年退行性疾病的症状。是否DR对PQMB引起的DA能系统损伤也具有保护作用？另外，既往已有实验表明星形胶质细胞（Astrocyte，Ast）过度激活在PD进展中起到一定的负面影响。在PQMB诱导的PD环境模型中，中脑Ast反应如何？DR与胶质细胞活化的关系如何？目前报道很少。 本实验拟采3第四军医大学硕士学位论文用DR对PQMB 诱导的PD小鼠模型施加干预，旨在探讨DR在其中的保护作用，并观察Ast的标志物——胶质细胞原纤维酸性蛋白（Glial fibrillary acidicprotein，GFAP）的表达与DR之间的关系，揭示DR可能的保护机制。实验内容如下： 实验一 目的：探讨PQMB 对小鼠黑质DA 能神经元及Ast 活化程度的影响。 方法：将C57BL/6J 小鼠随机分为药物注射组（PQMB 组）和生理盐水组（Saline 组）。PQMB 组按PQ 8 mg/kg，MB 24 mg/kg 剂量行腹腔注射，共6周。Saline 组腹腔注射0.9％无菌生理盐水，注射时间、剂量和方法同PQMB组。在PQMB 首次注射前（Blank group）和末次注射后处死动物，行黑质抗酪氨酸羟化酶（Tyrosine hydroxylase，TH）、GFAP 的免疫组化染色，观察PQMB 暴露对中脑DA 能神经元和Ast 的影响。 结果： PQMB 组小鼠黑质致密部（Substantial nigra pars compact，SNpc）TH阳性神经元数目为116.50 ± 7.44,显著少于Saline 组的178.83 ± 5.68（P < 0.001），以Blank 组的神经元数目作为基数进行标准化（后同），PQMB 组神经元百分比为70.2 ± 4.4％，减少了近30％。细胞形态呈现突起细小，分支减少等不健康表现。PQMB 组黑质Ast分布稀疏，胞体小、突起细而短，染色浅淡，Ast 的GFAP 免疫阳性产物表达少于Saline 组。PQMB 组相对灰度值（△Gray Value，△GV）为45.98 ± 1.46，低于Saline 组（P < 0.001）。 结论： PQMB 暴露对小鼠SNpc DA 能神经元有轻度的损伤作用，模拟了人类PD 的特征性病理学改变，同时对黑质区Ast也有一定的损伤作用。 实验二 目的： PQMB 对小鼠黑质的持续损伤效应及DR 对其的保护作用。 方法：按照实验一的方法将注射过PQMB 的动物随机分为PQMB 并随意（ad4第四军医大学硕士学位论文libitum，AL）进食组（PQMB/AL），PQMB 并饮食限制组（PQMB/DR）。以DR 干预后第0 周，3 周、5 周和8 周为观察时间点，行抗TH、GFAP 免疫组化染色，选取第5 周的部分切片行TH/GFAP 和Fos/TH 的双重标记染色。 结果： PQMB/AL 组小鼠SNpc TH 阳性神经元数目呈持续减少趋势，第8 周时为82.64 ± 5.10（相对数为49.8 ± 3.0 ％），明显少于0 周的116.50 ± 7.44（相对数为70.2 ± 4.4 ％）（P < 0.05）。而PQMB/DR 组，DA 能神经元数目缺失明显减缓，自DR 干预5 周起，PQMB/DR 与PQMB/AL 比较有显著差异（P <0.05）。PQMB/AL 组小鼠Ast 的活化程度经过短暂降低后开始上升，第3 周时恢复到对照组水平，之后呈升高趋势，第5、8 周△GV 分别为69.02 ± 1.25和63.3 ± 1.67，均高于同期对照组的51.66 ± 0.92 和53.04 ± 1.12（P < 0.01），而在PQMB/DR 组GFAP 的表达明显受到抑制，第5、8 周△GV 分别为48.92± 1.28 和47.5 ± 2.68，均低于同期PQMB/AL 组数值（P < 0.01）。 结论： PQMBPD 模型小鼠能够模拟人类PD DA 能神经元渐进性缺失的特点，而DR 可减缓这种持续损伤进程，DR 对Ast 活性的抑制可能是实现这一保护作用的机制之一。 实验三 目的：DR对PQMB联合暴露引起的小鼠运动功能损伤的影响。 方法：动物处理及分组同实验第一、二部分，在初次注射PQMB前（-6 周）和末次注射后各时间点（0、3、5、8 周）行自发活动实验和爬杆实验等行为学检测。 结果：动物经PQMB注射后出现急性行为学改变，如运动减少、后肢张开、僵直、步态不稳、弓背、竖尾、竖毛等。后期出现动作迟缓、肢体僵硬、步态不稳等症状。0 周时PQMB/AL组小鼠的水平运动距离（935.01 ±146.27 cm）小于Saline/AL组（1903.38 ± 203.14 cm），两组比较差异显著（P< 0.01）。同期爬杆实验中的Tturn和TLA分别为2.59 ± 0.21 s和13.85 ± 0.69 s，5第四军医大学硕士学位论文较Saline/AL组的0.90 ± 0.12 s和6.34 ± 0.37 s显著延长，两组间差异显著（P <0.01）。随着时间延长，PQMB/AL组小鼠行为学测试数据没有改善的趋势，而PQMB/DR组的水平运动距离和爬杆测试中的Tturn值在DR 5 周后明显改善，TLA在DR 8 周后改善明显，但行为学指标均未能达到对照组的水平。 结论： PQMB可引起小鼠运动功能减退，而较长时间DR干预后小鼠的运动功能有好转的趋势。