DNA损伤中NDRG2与P53的关系及NDRG2在P53信号转导通路中的功能研究

摘要

DNA是机体生命活动中最重要的遗传物质，其分子结构完整性和稳定性的保持对于细胞的存活和正常生理活动具有重要意义。但是DNA 时刻面临来自于生物体内部或外部的侵袭，在细胞内外各种损伤因素的作用下,受到不同程度的影响。生物体基因组完整性的维持依赖于体内相互独立但又密切联系的两套系统：DNA修复和凋亡。DNA损伤刺激产生一个信号，这一信号最终将被细胞周期或凋亡调控系统所接受。P53 分子是在DNA 损伤的信号转导途径中最重要的转录因子，其下游调控的靶基因，如P21 、14-3-3 、GADD45 和Bax 等分子，分别参与DNA 损伤后的细胞周期阻滞和细胞凋亡，在抑制细胞的癌变中发挥着重要作用。 人源NDRG2 ( 又名SYLD 或KIAA1248 )是我室在1999年利用基于PCR的消减杂交技术进行神经胶质瘤与正常脑组织的基因表达差异研究时发现的一个在多数肿瘤组织中表达降低的新基因[GenBank 登录号AF159092]，其mRNA 全长为2024bp，编码一个含有357 个氨基酸残基、分子量约41kDa的功能未知蛋白。该基因染色体定位在14q11.2，含有16 个外显子，15 个内含子。由于该基因在氨基酸序列上与已发现的N-myc 下游基因NDRG1(N-mycdown-stream regulated gene 1)具有较高的同源性，将其命名为NDRG2。近年来国内外学者对NDRG2 基因进行了较多的研究，对其功能已经有了一些了解。我们的前期研究发现，DNA损伤药物阿霉素- Adriamycin（简称Adr），可以诱导A549 细胞中NDRG2表达水平的升高，提示NDRG2 可能参与了细胞的DNA 损伤。而P53 分子是参与DNA 损伤修复中最重要的转录因子，我们通过生物信息学的方法也发现，NDRG2第一内含子区含有P53结合位点，并且已有研究报道，NDRG家族的另一成员—NDRG1，作为P53的靶基因参与了P53介导的细胞凋亡，以上背景提示DNA损伤中NDRG2与P53可能存在一定的关系，NDRG2在P53介导的信号转导通路中有可能发挥一定的功能。 为了验证上述假设，我们首先选用P53野生型细胞系A549和U87，应用促进DNA损伤的试剂Adr处理这些细胞不同时间后（0 h，3 h，6 h，12 h24 h），分别应用Real-time PCR和Western blot的方法检测到这些细胞中NDRG2的表达水平明显升高，提示NDRG2 参与了这两种细胞的DNA损伤过程。但是，应用Adr 处理P53突变型细胞系(MDAMB-231 和SK-BR-3)和P53缺失型细胞系(H1299)，却发现在这些P53失活的细胞系中，DNA损伤试剂Adr并不能诱导NDRG2表达水平的升高，上述研究表明DNA损伤诱导的NDRG2表达水平升高依赖于P53。 为了进一步明确P53与NDRG2的关系，我们通过在P53缺失的细胞系H1299中过表达外源性的P53，证实了NDRG2的表达水平随着P53表达水平的升高而升高。通过报告基因的分析表明，无论外源性的野生型P53 或内源性的野生型P53都可以特异地通过NDRG2 第一内含子区P53结合位点而明显上调报告基因的活性，并且通过ChIP和EMSA的方法证实了P53可以特异地与该P53结合位点相互作用，这些结果不仅为NDRG2是一个新的P53的靶基因提供了有力的证据，也为进一步研究NDRG2的功能提供了新的线索。 最后，我们对NDRG2在P53信号转导通路中发挥的功能及NDRG2对肿瘤细胞化疗敏感性进行了研究。结果表明，干涉NDRG2的表达可以明显抑制P53介导的细胞凋亡，提示NDRG2在由P53介导的细胞凋亡过程中发挥着举足轻重的作用；另外，过表达的NDRG2明显抑制了细胞的增殖，当应用化疗药Adr和顺铂处理NDRG2高表达的肿瘤细胞时，可以明显增强肿瘤细胞的化疗敏感性。以上研究结果表明，NDRG2作为P53的一个新的靶基因，在P53介导的细胞凋亡过程中发挥着重要作用，同时可以明显增强肿瘤细胞的化疗敏感性，并且证实了由过表达的NDRG2所增强的细胞的化疗敏感性可以不依赖于P53。 综上所述，NDRG2是P53的一个新的靶基因，参与了细胞中的DNA损伤反应，并且在P53介导的细胞凋亡中发挥着重要作用，同时又是一个可以增强肿瘤细胞化疗敏感性的新基因。因此，我们的研究不仅完善了对P53 的信号转导通路的认识，而且进一步明确了NDRG2的功能，为NDRG2在肿瘤治疗中的应用提供了有力的线索和依据。 我实验中的最后一部分内容与上述内容不太相关,是硕士课题的部分延续，目的主要是检测HepG2细胞中NDRG2表达降低的原因。我们首先通过PCR-SSCP的方法发现，在HepG2细胞中NDRG2的启动子区存在有突变，结果通过基因测序和报告基因的分析方法发现，在HepG2细胞中的NDRG2启动子区的-13bp处存在有C>T的突变，而这一突变可以明显降低NDRG2启动子的活性。该部分内容提示了NDRG2启动子区的突变是造成NDRG2在某些细胞中表达降低的原因之一，为研究其他肿瘤细胞系和肿瘤组织中NDRG2表达降低的原因提供了线索。