缺血后处理对大鼠肾脏缺血再灌注损伤及肾小管上皮细胞凋亡的影响

摘要

缺血后处理是最近提出的一种减轻靶器官缺血再灌注损伤的新方法，指在缺血器官全面恢复再灌注之前给予的反复多次的短暂再灌注－缺血处理。 目前的研究业已证实，在心脏、肝脏、脑等器官中，其保护效应和分子机制均与缺血预处理相似，但由于缺血后处理可以在靶器官缺血发生之后实施，临床可控性强，因而比缺血预处理具有更直接和广泛的应用价值。但是在肾脏中，缺血后处理是否具有类似的保护作用，目前尚未见相关报道，因此，我们首先建立了肾脏缺血后处理的大鼠模型，然后在此基础上对缺血后处理对肾脏的保护作用以及相关分子机制进行了研究。 目的： 成功建立肾脏缺血后处理大鼠模型，研究缺血后处理对肾脏的保护作用以及对肾小管上皮细胞凋亡的影响，探讨肾脏缺血后处理减少肾小管上皮细胞凋亡的分子机制。 方法： 首先将40 只SD 大鼠随机分为对照组（S 组）、缺血再灌注组（IR组）和3 个采用不同再灌注－缺血处理的缺血后处理组（IPO1、IPO2、IPO3组），分别制作动物模型，24h 后留取静脉血标本及肾组织，检测肾功能指标。然后在此基础上，选择成功建立模型的一组作为缺血后处理组（IPO 组），与对照组、缺血再灌注组进行形态学（光镜和电镜）方面的比较和观察，并通过免疫组织化学和Western 印迹等研究方法，对上述三组肾组织中的细胞凋亡相关分子（Caspase-3、Fas、Bcl-2、Bax）的表达进行检测，初步探讨肾脏缺血后处理减轻肾脏缺血再灌注损伤的分子机制。 结果： 在建立动物模型试验中，IPO3 组采用的是反复10 次再灌注20s－缺血20s 的后处理方式，该组血尿素氮水平为（27.95±3.21）mmol/L，血肌酐水平为（232.00±49.23）μmol/L，和IR 组相比，IPO3 组的血尿素氮、血肌酐水平均明显降低（ P＜0.01），其余两个缺血后处理组与IR 组相比差异无统计学意义（ P＞0.05）。 通过光镜和电镜等进行形态学观察，IR 组大鼠肾组织中可见间质水肿，残存的肾小管上皮细胞刷状缘消失，大量上皮细胞脱落、坏死，电镜下可见线粒体消失、内质网减少、染色质变性等，肾小管损伤程度评分为565.13± 63.98；IPO 组大鼠肾组织中间质轻度水肿，部分肾小管上皮细胞刷状缘脱落，可见少量管型，电镜下可见细胞器相对扩张，核染色质边聚等，肾小管损伤程度评分为382.00±47.63，与IR 组相比，IPO 组大鼠的光镜和电镜下的形态学改变较轻，且肾小管损伤程度评分明显降低（ P＜0.01）。 免疫组织化学染色结果显示，与IR 组相比，IPO 组肾组织中Caspase-3的表达无统计学意义（ P＞0.05）， Fas、Bax 的阳性染色指数分别为（21.17±4.81）％、（ 21.60±3.79）％，表达均明显降低（ P＜0.01）， Bcl-2 的阳性染色指数为（33.34±5.12）％，表达明显增高（ P＜0.01）。Western 印迹检测显示，IPO 组肾组织中，Caspase-3 酶原的表达强度为0.77±0.05，较IR 组高，活性Caspase-3 蛋白片段的表达强度为1.12±0.27，较IR 组低，差异均有统计学意义（ P＜0.01），各组之间总的Caspase-3 蛋白表达强度无统计学意义（ P＞0.05）；而与IR 组相比，Fas、Bcl-2、Bax 等蛋白的表达强弱，均与免疫组织化学染色结果相似。 结论： 在急性肾脏缺血后，采用反复10 次的再灌注20s－缺血20s 的后处理方式，可以成功建立肾脏缺血后处理大鼠模型。 功能学检测提示，肾脏缺血后处理可以降低肾脏缺血再灌注损伤大鼠的血尿素氮和血肌酐，对缺血再灌注损伤大鼠的肾功能具有保护作用。形态学观察提示，肾脏缺血后处理可以稳定缺血再灌注损伤大鼠肾小管上皮细胞的线粒体、内质网等超微结构，减少肾小管上皮细胞的凋亡和坏死，减轻肾小管损伤。 肾脏缺血后处理主要通过对外源性死亡受体凋亡途径启动分子Fas 和内源性线粒体凋亡途径启动分子Bcl-2、Bax 表达的调节来发挥抑制肾小管上皮细胞凋亡的作用，与缺血再灌注损伤相比，外源性途径仍然发挥相对较弱的促进凋亡作用，而内源性途径则主要发挥抑制凋亡的作用。