HLA-B27分子参与脊柱关节病发病机制的初步探讨

摘要

脊柱关节病(SpA)在我国的发病率和致残率都较高，但其病因及发病机制均未完全明了，其中，HLA-B27在SpA的发病中起重要作用。目前有关其参与SpA发病主要有以下几个假说：1) 分子模拟假说：HLA-B27 经典的HLA-I类分子结构通过将关节炎多肽提呈至CD8+T细胞的TCR上而诱导关节炎；2)HLA-B27异常形式的免疫识别：在多种因素影响下，细胞表面存在多种B27的异常形式，包括自由重链(FHC)，重链同源二聚体等，被特异的CD4+ T 细胞、NK细胞等识别从而诱发炎症损伤；3) 蛋白错误折叠，内质网应激与炎症反应：HLA-B27 在内质网的折叠速率减慢，造成内质网应激，引发未折叠蛋白反应(UPR)导致炎症反应。目前理论上有关SpA的发病机理更倾向于后两种假说。 在HLA-B27 转基因小鼠中发现，表达自由重链的细胞可能在SpA 中发挥重要作用，但在人的细胞研究中相关研究较少而且结果不一致。而有关蛋白错误折叠，内质网应激与炎症反应参与SpA 发病的假说，目前只在动物实验中得到部分证实。另外，单核巨噬细胞在SpA 中发挥着重要作用，但相对于类风湿关节炎(RA)，目前在这个领域研究较少。关于SpA 单核巨噬细胞分泌细胞因子的研究，目前大都集中在血清和滑液以及外周血或滑液单个核细胞(PBMC 或SFMC)，并不能真正反映单核细胞的功能状态，而且结论不一。 所以本课题旨在：1. 研究自由重链(FHC)在SpA 患者细胞上的表达及其B27 分子与这些自由重链的关系；2. 检测SpA 患者细胞尤其是单核巨噬细胞中是否存在内质网未折叠蛋白反应(UPR)，而且HLA-B27 分子在单核细胞系的过表达能否诱发UPR，初步判定HLA-B27 与UPR 反应参与SpA 的发病机理；3. 研究单核巨噬细胞分泌的细胞因子在SpA 中作用，并检测HLA-B27, HLA-A2 转染细胞在不同刺激条件下分泌的多种细胞因子，初步探讨HLA-B27 和单核细胞分泌细胞因子参与SpA 的发病机理。 方法：分三大部分。 1. 采用免疫荧光标记、流式细胞术测定了SpA患者外周血(PB)和滑液(SF)CD3+ 淋巴细胞和CD14+ 单核细胞上自由重链(FHC)的表达水平。同时用MHC-I单抗检测，以FHC相对于MHC-I的比例来表示FHC相对表达水平。 另外，我们研究了FHC表达水平与HLA-B27 表达以及疾病活动度之间的相关关系。另外采用转染HLA-B27-EGFP、HLA-A2-EGFP和EGFP的单核细胞系U937 细胞，检测其表面FHC表达水平。 2. 用流式细胞术检测SpA患者PB和SF CD3+细胞和CD14+细胞内GRP78 的表达，同时分离PB和SF单核细胞，用免疫荧光检测GRP78 表达和用半定量RT-PCR反应来检测UPR相关指标GRP78，CHOP，XBP-1 mRNA表达。另外，用免疫荧光和RT-PCR检测转染HLA-B27-EGFP、HLA-A2- EGFP和只转染EGFP的U937 细胞及其在不同刺激(PMA, LPS, IFN-γ, TNF-α) 条件下GRP78 表达和GRP78，CHOP，XBP-1 mRNA的表达。 3．用免疫磁珠阴性分选法分离出SpA 患者中PB 和SF 的单核巨噬细胞，在体外短期培养，用流式CBA 法检测分泌的多种细胞因子，并观察其与疾病活动指标和HLA-B27 的相关关系。同时检测转染HLA-B27-EGFP、HLA-A2-EGFP 和只转染EGFP 的U937 细胞及其在不同刺激条件（PMA,LPS, IFN-γ, TNF-α）下分泌的多种细胞因子的不同。 结果： 1．SpA患者外周血CD14+细胞上FHC的表达的相对水平较正常对照和RA患者显著增高，而CD3+淋巴细胞上三者的FHC相对表达水平无明显差异。同时FHC在SpA患者滑液CD14+单核巨噬细胞上相对表达更高。SpA患者PB和SF细胞上FHC的表达与B27 和β2-M表达水平无明显相关，但SpA患者SFCD14+ 细胞上FHC相对表达水平与患者ESR（相关系数r＝0.89），CRP （相关系数r＝0.78）和BASDAI（r＝0.67）均有显著相关性（P<0.05）。B27 表达阳性的U937细胞表面，未刺激和刺激后自由重链的表达都较多，与EGFP-U937和A2-U937相比有显著差异（P<0.05）。 2．SpA患者外周血和滑液CD14+细胞内GRP78 的的表达率较正常对照外周血显著增高(P<0.05)，SF较PB也有显著增加(P<0.05)。PCR结果显示与正常对照和SpA患者PB相比，SpA患者SF单核巨噬细胞中CHOP、GRP78 和XBP-1的表达都相对较强(P<0.05)。PCR结果也显示未刺激和PMA、IFN-γ、LPS和TNF-α刺激转染细胞后，CHOP、GRP78 和XBP-1 的表达在转染的三种细胞间均无显著差异。免疫荧光染色显示未刺激和TNF刺激情况下，三种转染细胞的GRP78 荧光表达强度无显著差异，而且B27-U937 细胞中B27 的表达与GRP78 的表达并不一致。而IFN-γ刺激后， B27 转染细胞的GRP78 表达较A2 -U937 和EGFP-U937 细胞增高。 3．对于磁珠分离出的外周血单核细胞培养上清，正常对照的细胞因子水平相对都较低，而AS 和RA 患者PB 中TNF-α，IL-10，IL-6 和IL-1β的表达水平较正常对照显著升高(P<0.05)。AS 和RA SF 分离出单核细胞培养上清中这些细胞因子的表达水平也较高。同时发现AS PB 分离细胞培养上清中IL-1β的表达与患者CRP 相关(r=0.425 P＝0.037)，而IL-8 的表达与ESR相关(r=0.413 P＝0.042)，但这些细胞因子与患者HLA-B27 表达强度之间均无明显相关。在转染细胞中，未刺激以及PMA、TNF 和IFN 刺激后的B27-U937 细胞表达的细胞因子和A2-U937 和EGFP-U937之间无明显差异。 但在细胞用LPS 刺激后，发现B27-U937 细胞分泌的IL-6，IL-1β和IL-10比另外两种细胞显著增高。 结论: 1．MHC-I类分子自由重链在SpA患者单核细胞表面表达增多，B27转染的U937细胞表面也发现高表达MHC-I自由重链，提示MHC-I类分子自由重链中HLA-B27分子可能占很大比例，从而参与SpA发病。 2．建立单核细胞分离、检测和B27表达阳性单核细胞株UPR检测等体系，首次证实SpA患者单核细胞中存在内质网UPR反应，可能参与了SpA的发病。 同时发现静息状态下B27的过表达与UPR反应可能无直接关系，而IFN-γ刺激可能会引起B27表达的细胞中UPR反应增加，其相关关系和机理还需进一步研究。此实验体系为进一步研究提供了较好基础，其初步结果也为明确UPR参与SpA的发病机制提供了重要线索。 3．发现AS患者单核细胞分泌的多种炎症因子TNF-α，IL-10，IL-6和IL-1β升高，可能在AS中发挥着重要作用。同时，发现LPS刺激后B27转染U937细胞也分泌更多的IL-6，IL-1β和IL-10，提示B27对于单核细胞在特定刺激条件下分泌的细胞因子有重要调节作用。 4．上述实验体系的建立，为我们的进一步研究提供了很好的保障，其结果为明确B27 分子及单核细胞是否通过B27异常形式的免疫识别和UPR 反应参与SpA发病提供了重要线索。