糙皮侧耳栽培种EST--SSR标记应用及初级核心种质库的构建

摘要

糙皮侧耳（Pleurotus ostreatus）是我国食用菌的主要栽培品种之一，但因其菌株名称混乱，同名异物、同物异名现象严重，一定程度上阻碍了食用菌产业的发展，因此需要一种快速、简便、稳定的鉴别分类方法。本文搜集整理了国内外糙皮侧耳栽培种的种质资源库，结合农艺学性状和EST-SSR分子标记技术构建了糙皮侧耳栽培种初级核心种质库,并初步进行了核心种质库的DNA指纹图谱分析。 从国内外糙皮侧耳栽培的主产区搜集整理栽培种共299株，通过品种栽培试验初步排除同种异名，结合来源地与栽培学农艺性状进行分区，根据菌丝生物学特性及子实体长势从中随机取样选出185株用于构建初级核心种质库。 通过搜索、剪切和重组NCBI等数据库公布的侧耳、灵芝、香菇的EST序列，用Primer5.0软件开发出9条侧耳EST-SSR引物，58条灵芝EST-SSR引物，35条香菇EST-SSR引物。通过优化试验确定PCR反应体系为（25μL）:10×缓冲液2.5μL，2.5 mmol的dNTPs2.0μL，2.5 U·μL-1 Taq酶0.25μL，10μM·L-1的正反向引物各1.0μL，模板50～100 ng; PCR反应程序为:94℃预变性5 min;94℃变性30 s;50～65℃复性45 s;72℃延伸1 min，35个循环;72℃延伸10 min;产物用2％的琼脂糖凝胶(含溴乙锭0.5μg/mL)电泳检测。 对灵芝引物和香菇引物在糙皮侧耳上进行了通用性研究:随机选取5株糙皮侧耳菌株对102对引物进行初筛，筛选出16对能扩增出条带的引物，占27％;6对香菇引物能扩增出条带，占17％;进一步在16个糙皮侧耳菌株上对灵芝的16对引物和香菇的6对引物进行复筛，其中4对灵芝引物和2对香菇引物能扩增出稳定、清晰且多态性好的带型。 重复试验选出4条多态性好、条带清晰的引物，对选取的185株糙皮侧耳栽培种进行扩增分析:共扩增得到59条带，每个引物扩增条带数为12～19条，扩增片段在100～1100 bp之间;根据扩增结果采用符合系数计算个体间的相似距离，用不加权类平均法(UPGMA)进行系统聚类;根据计算各位点等位基因的频率，确定各位点最低和最高频率的等位基因，优先选取具有这些稀有等位基因的个体作为核心材料;对于剩余的材料采用多次聚类随机取样法抽取核心种质，最终构建了一个含47株糙皮侧耳栽培种的初级核心种质库P-core47。 经分析得到:P-core47占原群体样品数25％，占资源库的13％;有效等位基因数和多态性位点占有率与原群体一致，多样性指数均值比原群体高0.12747，在原群体的低频率等位基因有所增强;P-core47内菌株来源广泛，基本已覆盖各个栽培地区，统计的质量性状和数量性状均可在其中找到代表性菌株，表明了利用EST-SSR分子标记构建糙皮侧耳栽培种初级核心种质库的可行性。 利用选取的4对EST-SSR引物对糙皮侧耳初级核心种质库中的47株菌株进行PCR扩增，并经凝胶成像系统成像分析，建立糙皮侧耳栽培种初级核心种质库的DNA指纹图谱，为种质资源库的管理和育种工作者对其材料的登记、评价、整理、分发、繁殖、利用等提供重要参考信息。

目录

声明

摘要

缩写词及英汉对照

第一章 前言

1．1 糙皮侧耳概况

1．2 侧耳分子标记技术研究进展

1．2．1 RFLP标记技术

1．2．2 RAPD标记技术

1．2．3 AFLP标记技术

1．2．4 ISSR标记技术

1．2．5 SCAR标记技术

1．2．6 ITS标记技术

1．2．7 IGS标记技术

1．3 SSR标记技术研究现状

1．4 核心种质的研究进展

1．4．1 核心种质构建策略

1．4．2 核心种质研究现状及意义

1．5 DNA指纹图谱

1．6 本研究的目的和意义

第二章 EST-SSR分子标记体系的建立

2．1 材料

2．1．1 供试材料

2．1．2 培养基及常用溶液

2．1．3 试剂及仪器

2．2 方法

2．2．1 供试菌株培养

2．2．2 供试菌株基因组DNA提取方法筛选

2．2．3 EST-SSR引物设计

2．2．4 PCR扩增及检测

2．2．5 PCR扩增体系优化

2．2．6 EST-SSR引物对糙皮侧耳的通用性研究

2．3 结果与分析

2．3．1 基因组DNA提取方法的筛选

2．3．2 EST-SSR分布特点

2．3．3 EST-SSR引物

2．3．4 PCR扩增体系优化

2．3．5 EST-SSR引物对糙皮侧耳的通用性研究

2．4 小结与讨论

第三章 糙皮侧耳初级核心种质库的建立

3．1 菌株搜集

3．2 方法

3．2．1 菌种活化

3．2．2 栽培试验

3．2．3 用于构建核心种质库的种质资源库筛选

3．2．4 基因组DNA的提取

3．2．5 引物复筛

3．2．6 多态性统计

3．2．7 数据处理

3．3 结果与分析

3．3．1 用于构建初级核心种质的种质资源库筛选

3．3．2 用于构建初级核心种质库的引物筛选

3．3．3 初级核心种质库的构建及聚类分析

3．3．4 初级核心种质的ESR-SSR DNA数字指纹图谱

3．4 小结与讨论

第四章 总结

参考文献

致谢

作者简历