基因修饰的骨髓间充质干细胞复合PLGA成骨实验研究

摘要

目的: 以含BMP-2 基因的腺病毒感染兔骨髓间充质干细胞诱导其表达成骨细胞表型，再将转染的MSCs 与高分子生物材料PLGA 支架相复合，在体内构建组织工程化骨，观察该方法的可行性和有效性，以期找到一种较好的修复骨缺损的方法。 方法: 采用密度梯度离心法自骨髓中分离培养兔骨髓间充质干细胞，观察原代及传代MSCs 形态特点、生长特性和特殊染色，探讨其作为骨组织工程种子细胞的可行性。以含BMP-2 基因的腺病毒感染MSCs 后，以MTT 法及流式细胞仪观察转染对细胞增殖活力及细胞周期的影响；用RT-PCR 法、免疫组化染色证实转基因MSCs 的BMP-2 蛋白表达情况；通过ALP 检测试剂盒检测两组细胞的ALP 活性；通过放免分析试剂盒检测两组细胞的骨钙素(osteocalcin, OCN)含量。制备孔径为150~300μm，孔隙率为90％的PLGA 与腺病毒感染后的兔MSCs 共培养，电镜观察了解细胞在PLGA 上粘附、生长和合成分泌骨基质成分的情况；并在体内构建组织工程化骨，通过组织学观察了解组织工程化骨形成情况。 结果: 经密度梯度离心法分离贴壁筛选后所得到的细胞，符合骨髓间充质干细胞特征。腺病毒感染后MSCs 形态特征、细胞增殖情况及细胞周期无显著变化，实验证实用Ad-BMP-2 转染的MSCs 具有成骨细胞的结构特征和生物学特性。转染后的MSCs 的碱性磷酸酶及骨钙素含量均较未转染组有显著增高，差异均有显著性意义(p<0.05)。制备得到的PLGA 为疏松多孔的网格样结构，具有一定的韧性和强度。将腺病毒感染的骨髓间充质干细胞接种于修剪成一定形状的PLGA 上，经电镜观察可见细胞贴附于材料表面和孔隙内并增殖。异位成骨实验证实该复合材料可形成新骨组织。 结论: 用密度梯度离心法分离骨髓间充质干细胞是可行的。分离获得的骨髓间充质干细胞体外培养显示，以1－5 代细胞作为组织工程的种子细胞是适宜的。PLGA 是一种良好的骨组织工程的载体材料，有利于种子细胞的粘附生长，并能在体外构建组织工程化骨。