HAb18G/CD147胞外片段蛋白质折叠复性研究

摘要

HAb18G/CD147是一个广泛表达的跨膜糖蛋白，参与机体多种生理和病理过程，尤其在肿瘤侵袭转移，炎症发生发展等方面起着重要的作用，其分子作用机制尚未明确、空间结构未解析。由于该分子功能与胞外片断域（HAb18GEP）密切相关，因此对HAb18GEP进行空间结构研究十分必要，而进行该项研究的根本前提和基础是需要制备大量、高纯度的蛋白质。 由于真核表达系统所固有的缺陷和复杂性，当前蛋白表达大多仍采用原核系统。然而外源蛋白在原核表达系统中往往形成不溶性的包涵体，这已成为当前蛋白质制备及结构研究的瓶颈。 另一方面，蛋白质通过何种途径折叠形成天然结构，也是长期困扰该领域研究的难题。研究蛋白质折叠机理和过程将有助于解释蛋白结构和功能的关系，并对阐述蛋白质与生命现象的本质有着极其深远的意义。 因此，本研究基于蛋白质折叠复性，旨在建立高效、实用的复性方法，以获得高纯度、高均一性天然结构蛋白HAb18GEP；另一方面，以蛋白折叠理论为依据，进行HAb18GEP折叠中间体的研究。 研究分为四个部分： （一）HAb18GEP的原核表达与纯化。 采用原核表达方式，筛选宿主菌种、优化培养条件，实现了HAb18GEP的高效表达，获得大量包涵体蛋白及微量可溶性蛋白。因其结构特点，以疏水相互作用色谱纯化包涵体蛋白、阴离子交换层析色谱纯化可溶性蛋白，所获蛋白纯度大于95％。ELISA测定其结合活性，以上两种蛋白均能与特异单抗结合，但包涵体蛋白亲和力较低。 制备高纯度的包涵体蛋白为HAb18GEP的高效复性奠定了基础，而纯化获得的可溶性蛋白为复性研究提供了天然蛋白标准品。 （二）甘油介导的疏水相互作用层析复性HAb18GEP。 采用甘油介导的疏水层析复性HAb18GEP。考察了介质类型、甘油添加等关键因素对复性效果的影响，并与稀释复性效果进行了比较。 本研究证实，疏水作用介质能够抑制复性过程中的蛋白聚沉，抑制作用与介质疏水性呈反比，但可导致蛋白的不可逆吸附；在层析流动相中加入甘油可克服以上不可逆吸附弊端，促进蛋白质的正确折叠。以此，建立了20％甘油介导的Poros ET 疏水层析柱复性HAb18GEP技术，可溶性蛋白回收达到83％，正确折叠率为30％。以上结果表明，采用弱疏水作用介质与适宜浓度的甘油洗脱相结合，既可以抑制聚沉又可以促进蛋白正确折叠。 （三）双梯度离子交换层析复性HAb18GEP。 采用稀释复性方法考察蛋白质浓度、复性缓冲液温度、盐类、添加剂等因素对HAb18GEP 折叠复性效率的影响，在此基础上研究了各因素对离子交换层析复性蛋白质的影响。 本研究证实，缓冲液的pH 值是影响蛋白质正确折叠以及二硫键正确配对的重要因素。因此，在用离子交换层析（IEC）复性含有两对二硫键的HAb18GEP 过程中，引入pH 梯度。变性蛋白质吸附于层析介质以后，环境的变性剂浓度逐步降低，pH 值渐次升高，蛋白质分子在柱中经历逐渐变化的液体环境，逐步实现了循序渐进式的折叠。 采用此方法复性HAb18GEP，可溶性蛋白回收率达95％，正确折叠率为67％，较甘油介导的疏水相互作用层析获得了更高的蛋白质正确折叠率，复性效率较为理想。 采用反相色谱分离正确折叠的蛋白,利用ELISA、圆二色谱、荧光光谱、核磁共振等方法进一步检测其空间结构。结果表明，复性后的HAb18GEP 具有良好的二级结构和三级结构，保持了天然蛋白质的理化性状。 （四）HAb18GEP折叠中间体研究。 蛋白质的生物学功能与其通过折叠形成的特定空间结构密切相关。“折叠途径”学说认为，在蛋白质折叠途径中必然有中间体的产生，这样才能减少蛋白质折叠所搜索的空间范围，解决“Levinthal 佯谬”。通过在脲中添加NaCl，成功地使HAb18GEP 的去折叠从两态过程转变为三态过程，并诱导出去折叠平衡态和动力学中间体。研究发现在NaCl 存在的条件下，HAb18GEP在高浓度脲中仍然存在一些残余的结构。NaCl 可能通过稳定这些残余结构使中间体得以形成。据此推测，在脲变性HAb18GEP 的去折叠过程中可能存在隐匿中间体。 本文分别以疏水相互作用层析和离子交换层析研究HAb18GEP包涵体蛋白复性，均获得成功，尤其是IEC实现了HAb18GEP包涵体的高效复性。复性后蛋白质结构及生物活性与天然态一致，能替代去糖基化的天然蛋白的结构研究，目前应用此方法制备的HAb18GEP已用于NMR结构解析。该方法的建立也为层析复性其它类似膜蛋白提供了借鉴和思路。 再则，本文以蛋白质“折叠途径”学说为基础，对HAb18GEP的折叠中间体进行了研究，发现氯化钠能够诱导脲变性HAb18GEP产生去折叠中间体，为深入研究蛋白质折叠途径提供了一定的实验依据，有助于了解不同折叠理论的内涵。