survivin启动子调控siRNA真核表达载体的构建及对HeLa 细胞中stathmin基因表达的抑制作用

摘要

目的: 探讨survivin 基因启动子调控的siRNA 真核表达载体对HeLa 细胞中stathmin 基因表达的肿瘤特异性封闭作用。 方法: (1) 将合成的siRNA 寡核苷酸链退火形成双链，连接入经BamHI和HindIII 双酶切后的pSilencer4.1-CMVneo 真核表达载体，酶切及测序鉴定。脂质体法转染重组质粒入HeLa 细胞，G418 筛选后RT-PCR 检测其对stathmin基因mRNA 的干涉效果。 （2）PCR 扩增suvivin 基因启动子并测序，用EcoRI和BamHI 分别双酶切，连接至经相同内切酶消化的载体，获得survivin 启动子调控的siRNA 真核表达载体，酶切及测序鉴定。脂质体法转染重组质粒入HeLa 细胞，G418 筛选。RT-PCR 扩增stathmin 基因，检测其对stathmin 基因表达的干涉效果；流式细胞仪分析转染后Hela 细胞增殖周期的改变。 结果： (1) 经酶切及测序鉴定，成功构建了CMV启动子调控的siRNA真核表达载体。经脂质体转染HeLa细胞后，RT-PCR结果显示HeLa细胞中stathmin基因的mRNA表达水平明显降低。 （2）经酶切及测序鉴定，成功构建了survivin基因启动子调控的stathmin基因siRNA真核表达载体；RT-PCR结果显示所构建的干涉载体可有效封闭stathmin基因表达；流式细胞仪分析结果显示，Hale细胞在stathmin-siRNA作用下G2/M期细胞的比例明显增加。 结论： (1) 成功构建了人stathmin基因的RNA干涉真核表达载体pSilencer4.1-S1 和pSilencer4.1-S2，并在HeLa细胞中有效的发挥了对stathmin基因表达的干涉作用。 （2）survivin基因启动子调控的siRNA真核表达载体可有效地封闭HeLa细胞中stathmin基因表达，并使Hela细胞阻断于G2/M期，为以stathmin基因为靶点的恶性肿瘤生物治疗奠定了理论基础。